猪产气荚膜梭菌的分离鉴定及药敏试验

底佳芳 郭文飞 徐恩娟 浙江汇能动物药品有限公司，杭州 310012

产气荚膜梭菌又称魏氏梭菌、产气荚膜杆菌，在自然界分布极广，可见于土壤、污水、饲料、食物、粪便以及人畜的肠道等中。该菌为条件性致病菌，在一定条件下，可引起多种严重疾病。鸡的坏死性肠炎以及仔猪红痢都是由产气荚膜梭菌感染所引起的严重的肠道疾病，该两病是影响养殖业经济效益的主要疾病，它可导致快速生长的肉鸡以及仔猪的死亡。在生产条件下，亚临床型产气荚膜梭菌病更为常见，由于动物没有明显的临床症状，常常被忽视，但其生长速度和饲料利用率明显下降，给养殖业造成较大的经济损失。同时带来了饲养管理上的麻烦。因此预防产气荚膜梭菌病的发生，对养殖业来讲十分重要。据资料报道，小剂量的那西肽即可抑制产气荚膜梭菌的生长，并对动物有较好的促生长效果。因此，本试验对四川地区的猪源产气荚膜梭菌野毒株进行分离和鉴定，并考察那西肽等药物对该菌株的抑制效果，为预防和治疗由产气荚膜梭菌引起的严重疾病提供理论依据。

1 试验材料

1.1 病料的来源

2008年12 月，某畜牧科技有限公司南充某养殖场出现了以仔猪下痢为主的疾病，3～10龄仔猪的下痢较严重,主要以黄痢为主。10龄后部分仔猪出现白痢，后逐渐恢复正常。在下痢过程中，部分体质较弱的仔猪和出现水样腹泻的仔猪发生死亡，死亡率在12%左右。将病死仔猪解剖后可以观察到，主要病变发生在小肠的空肠段和回肠段，表现为胀气，肠管内充满酸臭灰黄色的内容物，其它脏器无明显病变。病料选择病死仔猪的肝脏。

1.2 培养基

VF厌氧菌基础培养基，购自北京海淀中海动物保健科技公司；

亚硫酸盐-多粘菌素-磺胺嘧啶琼脂培养基（SPS）；

胰蛋白-亚硫酸盐-环丝氨酸琼脂培养基（TSC）；

血液琼脂培养基，购自杭州微生物试剂有限公司；

生化鉴定管，购自杭州微生物试剂有限公司。

1.3 试验药物（表1）

表1 进行药敏试验的药物品种

2 试验方法

2.1 产气荚膜梭菌的分离培养及鉴定

将肝脏病料放入VF培养基中厌氧培养，36℃培养过夜。将培养菌液分别接种SPS培养基、TSC培养基、血液培养基中，观察细菌生长状况，挑取可疑菌落在VF培养基中进行增菌培养。对VF培养基中的菌液进行革兰氏染色镜检观察，并进行生化鉴定。

2.2 药敏试验

2.2.1 药物有效成分的提取

根据兽药质量标准，将进行药敏试验的药物进行处理，提取出药物的有效成分备用。

2.2.2 采用试管稀释法测定药物对产气荚膜梭菌野毒株的最低抑菌浓度（MIC）

将提取出的药物的有效成分进行一系列不同倍数稀释，加入含有产气夹膜梭菌野毒株的VF厌氧基础培养基中，使各种药物在试管中的终浓度如表2，含有细菌和药物的试管于36℃培养箱中过夜培养，通过肉眼观察判定细菌生长情况。经培养后，如试管中的溶液澄清透明，说明没有细菌生长;如试管中溶液变浑浊，说明有细菌生产。通过细菌是否生长来判定药物对产气荚膜梭菌野毒株的MIC。

3 试验结果

3.1 产气荚膜梭菌的分离培养

将病料肝脏放入VF培养基中培养后观察，有大量气泡产生，将该菌液分别接种到SPS培养基、TSC培养基和血液培养基中培养过夜。

结果表明，细菌在SPS培养基上（图1）形成表面光滑、边缘整齐的黑色菌落，菌落凸起呈圆形（符合产气荚膜梭菌生长特性）。

细菌在TSC培养基上（图2）形成圆形凸起、表面光滑、边缘整齐的较大的黑色菌落（符合产气荚膜梭菌生长特性）。

在血液琼脂培养基上（图3）可见菌落凸起，呈圆形，表面光滑，边缘整齐，呈现淡灰色。菌落周围有双层溶血圈，内圈透明，外围浅绿（符合产气荚膜梭菌生长特性）。

3.2 产气荚膜梭菌的鉴定

挑取SPS培养、TSC培养基上的黑色菌落和血液琼脂培养上的双溶血环菌落，接种到VF培养基中，36℃培养过夜。培养物进行革兰氏染色镜检观察，并接种于生化鉴定管中，试验结果见图4和表3。

从图4可见，细菌单个或成对存在，为两端钝圆、短杆状、粗大正直的杆菌，革兰氏染色阳性，无鞭毛，无芽孢。

通过细菌在SPS培养基、TSC培养基和血液琼脂培养基上的生长特性，以及革兰氏染色镜检和生化鉴定结果可知，该细菌即为产气荚膜梭菌。将该菌株命名为ZSTG001。

3.3 不同药物对产气荚膜梭菌的野毒株ZSTG001的抑菌试验结果

3.3.1 恩拉霉素对产气荚膜梭菌的野毒株ZSTG001的抑菌试验结果

试验结果见图5。从图5可以看出，后3只试管中的液体混浊，并伴有大量气泡的产生，第7只试管中虽然没有气体产生，但试管中的溶液也呈现混浊状，说明均有细菌生长。其余试管中的溶液澄清透明，说明没有细菌生长。因此本试验中恩拉霉素对产气荚膜梭菌的野毒株ZSTG001的最小抑菌浓度（MIC）为 0.1μg/ml。

3.3.2 维基尼亚霉素对产气荚膜梭菌的野毒株ZSTG001的抑菌试验结果

试验结果见图6。从图6可知，前7只试管中的液体均为澄清透明，说明没有细菌生长。后3只试管中的液体呈现混浊状，并伴有大量的气泡产生，说明试管中有细菌生长。因此本试验中维基尼亚霉素对产气荚膜梭菌的野毒株ZSTG001的最小抑菌浓度（MIC）为 0.5μg/ml。

3.3.3 阿维拉霉素对产气荚膜梭菌的野毒株ZSTG001的抑菌试验结果

试验结果见图7。从图7可知，10只试管仅前2只试管中的溶液澄清透明，没有细菌生长，其余试管中均有细菌生长。因此本试验中阿维拉霉素对产气荚膜梭菌的野毒株ZSTG001的最小抑菌浓度（MIC）为 10μg/ml。

3.3.4 杆菌肽锌对产气荚膜梭菌的野毒株ZSTG001的抑菌试验结果

试验结果见图8。从图8可知，前5只试管中的液体均为澄清透明，说明没有细菌生长。后5只试管中的液体呈现混浊状，并伴有气泡产生，说明试管中有细菌生长。因此本试验中杆菌肽锌对产气荚膜梭菌的野毒株ZSTG001的最小抑菌浓度（MIC）为 10μg/ml。

3.3.5 喹乙醇对产气荚膜梭菌的野毒株ZSTG001的抑菌试验结果

试验结果见图9。从图9可以看出，前5只试管中的溶液澄清透明，说明试管中没有细菌生长。而后5只试管中的溶液呈现混浊状，并伴有大量的气泡产生，说明试管中有细菌生长。因此本试验中喹乙醇对产气荚膜梭菌的野毒株ZSTG001的最小抑菌浓度（MIC）为 10μg/ml。

3.3.6 吉他霉素对产气荚膜梭菌的野毒株ZSTG001的抑菌试验结果

试验结果见图10。从图10可以看出，前5只试管中的溶液澄清透明，说明没有细菌生长。其余试管中的溶液均呈现混浊状，并伴有气泡产生，说明有细菌生长。因此本试验中吉他霉素对产气荚膜梭菌的野毒株ZSTG001的最小抑菌浓度（MIC）为1μg/ml。

3.3.7 盐酸林可霉素对产气荚膜梭菌的野毒株ZSTG001的抑菌试验结果

试验结果见图11。从图11可知，这10只试管中的液体均呈现不同程度的混浊状，前3只试管中的液体呈现略微混浊，说明也有细菌生长的迹象。因此本试验中盐酸林可霉素对产气荚膜梭菌的野毒株ZSTG001 的最小抑菌浓度（MIC）大于 200μg/ml。

3.3.8 那西肽对产气荚膜梭菌的野毒株ZSTG001的抑菌试验结果

试验结果见图12。从图12可以看出，仅后3只试管中的液体为混浊状，并伴有气泡产生，说明这3只试管中有细菌生长，其余试管中的液体均为澄清透明，没有细菌生长。因此本试验中那西肽对产气荚膜梭菌的野毒株ZSTG001的最小抑菌浓度（MIC）为 0.0025μg/ml。

图5 恩拉霉素对产气荚膜梭菌野毒株ZSTG001的抑菌效果

图6 维基尼亚霉素对产气荚膜梭菌野毒株ZSTG001的抑菌效果

图8 杆菌肽锌对产气荚膜梭菌野毒株ZSTG001的抑菌效果

图9 喹乙醇对产气荚膜梭菌野毒株ZSTG001的抑菌效果

图10 吉他霉素对产气荚膜梭菌野毒株ZSTG001的抑菌效果

图11 盐酸林可霉素对产气荚膜梭菌野毒株ZSTG001的抑菌效果

图12 那西肽对产气荚膜梭菌野毒株ZSTG001的抑菌效果

3.3.9 药敏试验结果小结

不同药物对产气荚膜梭菌的野毒株ZSTG001的抑菌结果见表4。

4 结论

4.1 细菌的分离鉴定

从肝脏病料中分离的细菌在SPS培养基上生长特点为边缘整齐、光滑凸起的针尖般黑色菌落；在TSC培养基上呈现菌落较大、凸起呈圆形、边缘整齐的黑色菌落；该细菌在血液琼脂培养基上可见菌落凸起，呈淡灰色。菌落周围有双溶血圈，内圈透明，外圈呈现浅绿色。镜检观察细菌为革兰氏染色阳性，单个或成对存在，两端钝圆、短杆状的粗大直杆菌。并且该细菌可发酵葡萄糖、蔗糖、果糖、麦芽糖、乳糖，不能发酵木糖、甘露醇和水杨苷，吲哚试验为阴性，H2S、MR和硝酸盐还原及明胶试验均为阳性。通过上述的细菌生长特性及生化试验，可判定分离的细菌即为产气荚膜梭菌。

4.2 不同药物对产气荚膜梭菌野毒株的抑菌效果

这8种药物对该产气荚膜梭菌野毒株有不同的抑制作用，其中以那西肽的抑菌效果最好，其MIC值为0.0025μg/ml；其次为恩拉霉素、维基尼亚霉素和吉他霉素，他们的 MIC 值分别为 0.1μg/ml、0.5μg/ml和1μg/ml；阿维拉霉素、杆菌肽锌和喹乙醇对产气荚膜梭菌野毒株的抑制效果相同，MIC值为10μg/ml；而盐酸林可霉素对该分离的产气荚膜梭菌的野毒株几乎没有抑制作用，其MIC值大于200μg/ml。