HPLC法测定麻仁胶囊中大黄素及大黄酚的含量*

金 鑫，曲 佳，李时放

(1.天津市中心妇产科医院，天津 300052； 2.天津市药品检验所，天津 300070)

麻仁胶囊由熟大黄、火麻仁、苦杏仁、枳实、厚朴、白芍共6味中药组成，具有润肠通便的功效，用于肠燥便秘等症。处方中大黄具有泻热通肠，凉血解毒，逐瘀通经等功效，原质量标准收载于中华人民共和国卫生部部标准WS3-41(X-32)-93(Z)，其中无含量测定，故采用HPLC法，以大黄素、大黄酚为定量指标，建立了处方中大黄的含量测定方法。修订后的质量标准方法简便、准确、专属性及重现性好，可用于麻仁胶囊的质量控制。

1 仪器与试药

日本SHIMADZU LC-2010CHT高效液相色谱仪，LC-solution工作站。大黄素对照品(中国药品生物制品检定所提供，批号1100756-200110，为含量测定用)；大黄酚对照品(中国药品生物制品检定所提供，批号110796-200615，为含量测定用)。麻仁胶囊(规格：0.35 g/粒，批号061001、061002、061201、070101、070201、071201、080101、080102、080301、080401)，甲醇为色谱纯，磷酸为分析纯，水为去离子水。

2 方法与结果

2.1色谱条件 色谱柱为Sepax Sapphire-C18(4.6 mm×250 mm, 5 μm)；检测波长为254 nm；流动相：甲醇-0.1 %磷酸溶液(85∶15)；柱温：40 ℃；流速：1.0 ml/min；理论板数按大黄素峰计算为13 716，分离度为5.5。

2.2溶液的制备

2.2.1对照品溶液的制备 分别取大黄素、大黄酚对照品适量，精密称定，加乙酸乙酯-无水乙醇(1∶2)混合溶液制成每1 ml含大黄素10 μg、含大黄酚15 μg的混合溶液，即得。

2.2.2供试品溶液的制备 取“装量差异”项下的本品内容物，研细，取0.7 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 ml，称重，加热回流30 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密吸取续滤液5 ml，蒸干，残渣加盐酸-30%乙醇溶液(3∶10)混合溶液15 ml，置水浴中加热水解50 min，用三氯甲烷振摇提取5次，每次15 ml，合并三氯甲烷液，蒸干，残渣用乙酸乙酯-无水乙醇(1∶2)混合溶液溶解，置25 ml量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.3阴性对照溶液的制备 按处方配比，取除大黄外的其他药材，按处方工艺制成制剂，再按“2.2.2”项下方法制得阴性对照溶液。分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液及阴性对照溶液各10 μl，注入液相色谱仪，按“2.1”色谱条件分析。结果阴性对照样品在大黄素、大黄酚相应的保留时间处未见色谱峰。结果表明，阴性对照样品对检测无干扰，结果见图1。

2.3线性关系考察 分别取大黄素、大黄酚对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 ml含大黄素分别为0.00075525、0.0015105、0.00377625、0.0075525、0.01132875、0.015105、0.01888125 mg，还分别含大黄酚为0.001578、0.003156、0.00789、0.01578、0.02367、0.03156、0.03945 mg的混合溶液，作为储备液，分别精密吸取上述7种浓度的对照品溶液各10 μl，注入液相色谱仪，按“2.1”色谱条件分析，测定各自峰面积，以对照品进样量(μg)为横坐标，峰面积值为纵坐标，求得回归方程：Y大黄素=4.0×106X-4.8×102(r=1.000 0)；Y大黄酚=5.4×106X-5.2×102(r=1.000 0)。结果表明大黄素在0.007 552 5～0.188 812 5 μg范围内线性良好；大黄酚在0.015 78～0.394 5 μg范围内线性良好。

1.大黄素 2.大黄酚

2.4精密度试验 取同一批号(071201)样品内容物，研细，取1份，按照“2.2.2”方法制备供试品溶液，按“2.1”色谱条件分析，连续进样6次，测定样品中大黄素、大黄酚的峰面积，结果大黄素峰面积值的RSD为0.1%；大黄酚峰面积值的RSD为0.1%。

2.5重复性试验 取同一批号(071201)样品内容物，研细，取6份，按照“2.2.2”供试品溶液制备方法操作，按“2.1”色谱条件分析，测定每份样品中大黄素、大黄酚的含量。结果6份样品中大黄素的平均含量为2.3597 mg/g，RSD为2.9%；大黄酚的平均含量为5.6964 mg/g，RSD为1.1%，表明本方法重复性良好。

2.6稳定性试验 取同一批号(071201)样品内容物，研细，取1份，按照“2.2.2”供试品溶液制备方法操作，按“2.1”色谱条件分析，分别在0、2、4、6、8、10、12 h测定样品中大黄素、大黄酚峰面积，结果大黄素峰面积值的RSD为0.3%；大黄酚峰面积值的RSD为0.1%。结果表明供试品溶液在12 h内稳定。

2.7回收率试验 取同一批号(071201)样品内容物，研细，取0.35 g，共6份，精密称定，分别精密加入每1 ml含大黄素对照品0.023 62 mg、含大黄酚对照品0.057 44 mg的混合对照品甲醇溶液50 ml，再按照“2.2.2”项下供试品溶液制备操作，制得供试品溶液，按“2.1”色谱条件分析，计算回收率，结果大黄素平均回收率为99.58%，RSD为0.74%；大黄酚平均回收率为98.98%，RSD为1.83%，结果见表1和表2。

表1 大黄素加样回收试验测定结果(n=6)

表2 大黄酚加样回收试验测定结果(n=6)

2.8样品测定 取10个批号的样品，按照“2.2.2”供试品溶液制备操作，按“2.1”色谱条件分析，测定样品中大黄素、大黄酚的含量，结果见表3。

表3 样品含量测定结果

3 讨论

3.1波长的选择 通过对大黄素对照品溶液在200～400 nm处进行紫外光谱扫描检测显示，大黄素、大黄酚在254 nm处有最大吸收，与文献[1]采用的波长基本相同。

3.2提取方法的选择

3.2.1提取方式的选择 取“装量差异”项下同一批号(071201)样品内容物，研细，取0.7 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇15 ml，称重，分别采用超声处理与加热回流的方式，提取时间均为45 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密吸取续滤液5 ml，蒸干，残渣加盐酸-30%乙醇溶液(3∶10)混合溶液15 ml，置水浴中加热水解50 min，用三氯甲烷振摇提取5次，每次15 ml，合并三氯甲烷液，蒸干，残渣用乙酸乙酯-无水乙醇(1∶2)混合溶液溶解，置25 ml量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。结果显示，提取溶剂为甲醇，采用加热回流方式(7.969 2 mg/g)高于超声处理方式(6.576 0 mg/g)，故将提取方式定为加热回流。

3.2.2提取溶剂用量的选择 取“装量差异”项下同一批号(071201)样品内容物，研细，取0.7 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入甲醇25、50、100 ml，称重，加热回流30 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密吸取续滤液5 ml，蒸干，残渣加盐酸-30%乙醇溶液(3∶10)混合溶液15 ml，置水浴中加热水解50 min，用三氯甲烷振摇提取5次，每次15 ml，合并三氯甲烷液，蒸干，残渣用乙酸乙酯-无水乙醇(1∶2)混合溶液溶解，置25 ml量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，测定样品中大黄素与大黄酚的含量之和。加入25.50、100 ml甲醇提取后大黄素和大黄酚含量之和分别为7.765 0、7.931 5和7.597 1 mg/g。结果显示，加入甲醇50 ml高于其他两种溶剂量，故将提取溶剂量定为50 ml，可将所测成分提取完全。

3.2.3提取时间的选择 取“装量差异”项下同一批号(071201)样品内容物，研细，精密称取0.7 g，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇15 ml，称重，分别加热回流15、30、60 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密吸取续滤液5 ml，蒸干，残渣加盐酸-30%乙醇溶液(3∶10)混合溶液15 ml，置水浴中加热水解50 min，用三氯甲烷振摇提取5次，每次15 ml，合并三氯甲烷液，蒸干，残渣用乙酸乙酯-无水乙醇(1∶2)混合溶液溶解，置25 ml量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，测定样品中大黄素与大黄酚的含量之和。结果15、30、60 min提取的大黄素和大黄酚的含量之和分别为7.440 2、7.469 3和7.494 4 mg/g。30 min与60 min测定结果的相对平均偏差为0.17%，认为30 min提取时间可行，故将提取时间定为30 min。结果见表9。

3.2.4提取酸度的选择 取“装量差异”项下同一批号(071201)样品内容物，研细，取0.7 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入甲醇50 ml，称重，加热回流30 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密吸取续滤液5 ml，蒸干，残渣分别加盐酸-30 %乙醇溶液(1∶10)、(3∶10)混合溶液各15 ml，置水浴中加热水解50 min，用三氯甲烷振摇提取5次，每次15 ml，合并三氯甲烷液，蒸干，残渣用乙酸乙酯-无水乙醇(1∶2)混合溶液溶解，置25 ml量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，测定样品中大黄素与大黄酚的含量之和。结果显示，采用盐酸-30%乙醇溶液(3∶10)混合溶液(7.609 7 mg/g)高于(1∶10)的混合溶液(7.383 5 mg/g)，故将提取酸度定为(3∶10)，可将所测成分提取完全。

3.2.5酸水解时间的选择 取“装量差异”项下同一批号(071201)样品内容物，研细，取0.7 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入甲醇50 ml，称重，加热回流30 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密吸取续滤液5 ml，蒸干，残渣加盐酸-30%乙醇溶液(3∶10)混合溶液各15 ml，置水浴中分别加热水解30、50、90 min，用三氯甲烷振摇提取5次，每次15 ml，合并三氯甲烷液，蒸干，残渣用乙酸乙酯-无水乙醇(1∶2)混合溶液溶解，置25 ml量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，测定样品中大黄素与大黄酚的含量之和酸水解30、50和90 min，样品中大黄素和大黄酚的含量之和分别为7.609 7、7.853 1和7.977 3 mg/g。结果显示，酸水解50 min与90 min，提取大黄素与大黄酚总量基本一致，二者RAD为0.78%，故将酸水解时间定为50 min，可将所测成分提取完全。且采用三氯甲烷萃取5次后，已将大黄素、大黄酚萃取完全。

3.3耐用性试验

3.3.1不同色谱柱对含量测定的影响 取批号为071201的样品，制成供试品溶液，分别用Sepax Sapphire-C18、Phenomenex-C18色谱柱，采用SHIMADZU-LC-2010CHT高效液相色谱仪，按照“2.1”色谱条件，测定样品中大黄素、大黄酚含量之和分别8.060 2和8.153 3 mg/g，二者RAD为0.09%。

3.3.2不同仪器对含量测定的影响 取批号为071201的样品，制成的供试品溶液，用色谱柱，分别采用SHIMADZU-LC-2010CHT与SHIMADZU LC-2010C高效液相色谱仪，按照“2.1”色谱条件分析，测定样品中大黄素、大黄酚含量之和分别为8.060 2和7.943 0 mg/g，二者RAD为0.73%。结果显示，采用相同仪器，不同色谱柱，与采用相同色谱柱，不同仪器对测定结果均无影响。因此，建立的该含量测定方法耐用性良好，具有可行性。

1 中国药典.一部.2005：603