二氢杨梅素对乳腺癌荷瘤小鼠化疗的增效减毒作用*

周防震 黄敏 张晓元 郭勇

(1.华南理工大学生物科学与工程学院，广东广州510006;2.广州军区机关门诊部，广东广州510080;3.华南理工大学工业技术研究总院，广东广州510640)

恶性肿瘤患者大多数均需进行化疗，但化疗药物在杀伤或杀死肿瘤细胞的同时，对体内正常的组织细胞也具有明显的损伤作用.机体过量产生的活性氧被认为是化疗药物毒副作用的根源［1-3］.文献资料显示联合化疗药物和具有抗氧化活性的化学预防试剂可以增加化疗试剂的抗肿瘤作用，降低化疗药物诱导的毒副作用［4］.

二氢杨梅素(DMY)化学名为 3，5，7，3＇4＇5＇-六羟基-2，3双氢黄酮醇，是从藤茶(Ampelopsis grossedentata)等植物茎叶中提取的一种二氢黄酮醇化合物.研究表明DMY具有抗氧化、保肝护肝、降血糖、增强人体免疫力等多种生理活性［5］.阿霉素(ADM)作为一种周期非特异性广谱抗癌药物，对多种肿瘤有明显疗效，已广泛应用到乳腺癌的临床化疗中，但其与剂量依赖性相关的心肌毒性、骨髓抑制和肝毒性等副作用限制了它的临床使用［6-7］.前期实验表明，离体条件下DMY能增加乳腺癌细胞对ADM的敏感性，表现出一定的协同增效作用［8］，但关于其在肿瘤化疗中的增效减毒作用未见报道.文中通过建立4T1乳腺癌细胞Balb/C小鼠体内移植肿瘤模型，探讨DMY与ADM联合应用时的体内抗肿瘤作用，以期为DMY作为化疗辅助药物的开发和利用提供依据.

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物和瘤株

SPF级Balb/C小鼠36只，雌性，体重13～15g，购于广东省实验动物中心，合格证编号为0076054.实验前适应性驯养1周.饲料和垫料均购于广东省实验动物中心.实验期间自由采食饮水.小鼠乳腺癌4T1瘤株由暨南大学生物工程研究所提供.

1.1.2 药物

DMY从藤茶(A.grossedentata)中以水提醇沉和重结晶方法分离纯化，并通过高效液相色谱、紫外光谱、红外光谱和质谱等检测和鉴定，纯度为96%.注射用盐酸阿霉素(ADM)由浙江海正药业有限公司生产.

1.2 方法

1.2.1 肿瘤模型的建立

参照孙凤梅［9］的方法建立乳腺癌荷瘤小鼠模型.以胰酶消化方式收集对数生长期4T1细胞，利用台盼蓝计数细胞，14℃、800r/min离心5min，除去上清液，将细胞悬浮于磷酸盐缓冲液(PBS)中，调整细胞密度为1×104个/μL，小鼠麻醉后，每只小鼠于右后腿皮下注射50μL细胞悬液.

1.2.2 动物分组

接种次日开始进行药物干预.小鼠随机分成4组，每组9只.分组如下:对照组(生理盐水溶液处理)、2mg/(kg·d)ADM 组、100mg/(kg·d)DMY 组以及联合用药(100mg/(kg·d)DMY+2 mg/(kg·d)ADM)组.

1.2.3 抑瘤率和肺转移灶数的计算

DMY采用灌胃给药的方式，每天固定时间给药，连续给药27 d.ADM采用腹腔注射(ip)，给药3d、停药3 d为一个周期.每天测量小鼠体重，第5个周期的第4天取血后处死动物.剥离肿瘤并称重，计算抑瘤率［10］.解剖取出小鼠肺脏，以冰冷的PBS清洗后，以4%的多聚甲醛固定过夜，Leika双目解剖镜8倍下计数小鼠肺脏(共5叶)表面转移群落的数量.

1.2.4 心肝功能的血清检测

眼球采血后离心，取上清.利用全自动生化分析仪测定血清乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶(CK)、谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)水平.

1.2.5 统计方法

2 结果与分析

2.1 DMY对小鼠瘤重及抑瘤率的影响

各组实验鼠给药27 d后处死，剥离肿瘤，观察发现肿瘤呈灰白色，浸润，质硬.各药物均能一定程度抑制瘤体的增长，单独使用2 mg/(kg·d)ADM能显著减少瘤重(P＜0.05)，100 mg/(kg·d)DMY组小鼠的瘤重相比对照组无显著差异，100mg/(kg·d)DMY与2 mg/(kg·d)ADM联合用药组小鼠瘤重显著小于对照组(P＜0.01)，2 mg/(kg·d)ADM、100 mg/(kg· d)DMY、2 mg/(kg· d)ADM+100mg/(kg·d)DMY组的抑瘤率分别为28.44%、11.84%和46.92%(见表1).

2.2 DMY对小鼠乳腺癌肺转移的影响

药物干预下荷瘤小鼠肺部转移灶数如图1所示.从图1可以看出:各药物处理组小鼠肺部转移灶数显著低于对照组(P＜0.01);2 mg/(kg·d)ADM组小鼠肺部转移灶数小于100 mg/(kg·d)DMY组，但无显著差异;而100 mg/(kg·d)DMY联合2mg/(kg·d)ADM组小鼠肺部转移灶数显著小于2mg/(kg·d)ADM组(P＜0.05).

图1 药物干预下荷瘤小鼠肺部转移灶数Fig.1 Lung metastatic loci in tumor-bearing mice treated with drug intervention

2.3 DMY对化疗荷瘤小鼠心脏毒性的影响

各组实验鼠给药27 d后的血清生化分析表明，100mg/(kg·d)DMY组小鼠的LDH水平显著低于对照组(P＜0.05)，而2mg/(kg·d)ADM处理能显著增加血清中LDH的含量(P＜0.01)，100mg/(kg·d)DMY联合2 mg/(kg·d)ADM处理能显著降低ADM诱导的LDH的增加量(P＜0.05)，但相对于对照组并无显著差异(见图2).

图2 药物干预下荷瘤小鼠的血清LDH水平Fig.2 Serum LDH level in tumor-bearing mice treated with drug intervention

图3显示了单独使用2 mg/(kg·d)ADM或100mg/(kg·d)DMY处理的结果，发现荷瘤小鼠血清的CK水平虽有变化但并无统计学上的显著差异，而二者联合使用可以显著降低血清CK水平(P＜0.05).

图3 药物干预下荷瘤小鼠的血清CK水平Fig.3 Serum CK level in tumor-bearing mice treated with drug intervention

2.4 DMY对化疗荷瘤小鼠肝毒性的影响

药物干预下荷瘤小鼠的血清ALT水平如图4所示.从图4中可以看出，单独使用2 mg/(kg·d)ADM或100mg/(kg·d)DMY，或者二者联合使用时，荷瘤小鼠血清的ALT水平相对于对照组并无明显差异，但联合使用 2 mg/(kg·d)ADM和100mg/(kg·d)DMY的处理组荷瘤小鼠血清的ALT水平低于单独使用2mg/(kg·d)ADM的处理组(P=0.058).

图4 药物干预下荷瘤小鼠的血清ALT水平Fig.4 Serum ALT level in tumor-bearing mice treated with drug intervention

药物干预下荷瘤小鼠的血清AST水平如图5所示.统计分析发现，单独使用2 mg/(kg·d)ADM的处理组荷瘤小鼠血清中的AST水平显著高于对照组(P＜0.05)，而单独使用100 mg/(kg·d)DMY的处理组以及联合用药组荷瘤小鼠血清的AST水平相对于对照组无显著变化.

图5 药物干预下荷瘤小鼠的血清AST水平Fig.5 Serum AST level in tumor-bearing mice treated with drug intervention

3 讨论

实验过程中发现，DMY+ADM联合用药组的小鼠毛色相对于单独ADM组更具光泽，且ADM停药期，联合用药组的小鼠进食情况明显优于单独ADM用药组.由于血清中LDH、CK和ALT、AST水平分别是反应心肌细胞和肝细胞损伤的重要指标，实验结果表明DMY能减轻ADM引起的心肝毒性，对小鼠心肌细胞和肝细胞具有一定的保护作用.苏东林等［11］的研究也发现DMY对酒精性肝损伤具有保护作用，但DMY对ADM引起的心脏毒性的保护作用尚属首次报道.

ADM是细胞周期非特异性药物，主要通过将肿瘤细胞阻滞于G2/M期而发挥其直接杀伤作用［12］.作用机理不同的药物联合使用可能通过互补作用增强了抗肿瘤效果［13］，DMY对ADM的增效作用可能与DMY的抗肿瘤机制有关.DMY具有很强的抗氧化作用［14-15］，研究中发现联合用药组小鼠的脾脏指数大于单独ADM用药组，表明DMY减轻ADM心肝毒性的机制可能与其抗氧化作用有关.郑宏强、刘德育等［16-17］的研究也发现浓度小于100 μmol/L的DMY(相当于32mg/L)不仅对黑色素瘤B16细胞不产生毒性作用，还能明显抑制B16细胞的侵袭、运动和粘附.由本研究可以看出，与对照组相比，100mg/(kg·d)DMY能显著减少荷瘤小鼠肿瘤肺部转移灶数和瘤重，暗示抑制肿瘤转移可能是DMY的主要抗肿瘤作用机制.

4 结语

文中探讨了DMY对乳腺癌荷瘤小鼠化疗的增效减毒作用，结果显示，100mg/(kg·d)DMY联合2mg/(kg·d)ADM处理能明显提高ADM对Balb/C小鼠乳腺癌移植瘤的抑瘤率，减少肿瘤肺转移灶数，从而显著增加ADM化疗的抗肿瘤效果.血清生化分析显示DMY与ADM联合使用可减少ADM单独使用所造成的血清LDH、ALT和AST水平的增加量，表明DMY能降低ADM引起的心、肝毒性反应.DMY对荷瘤小鼠ADM化疗的增效和减毒作用拓展了DMY的新应用，为将其开发为化疗药物的辅助药物提供了参考，但其具体机制尚需进一步研究.

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