益心解毒颗粒质量标准研究

林玉红 杨娟英 谢 伟 王月茹 陕西步长制药有限公司(西安 710075)

益心解毒颗粒由黄芪、麦冬、地黄、金银花、黄连、五味子、防风、酸枣仁和丹参等中药材组成,具有益气养阴,清热解毒之功效。用于病毒性心肌炎气阴两虚、热侵心包证型。证见心悸,气短,胸闷不适,乏力,低热,咽干咽痛,五心烦热,心烦,多汗,失眠,舌淡红或舌红,苔薄黄或薄白,脉沉细或结代者。为能有效控制益心解毒颗粒的质量,本实验采用薄层色谱法及高效液相色谱法对其进行了质量标准的研究。

1 仪器与试药 1.1 仪器 Waters 600高效液相色谱仪,Alltech500型 ELSD检测器,M illennium 32色谱工作站。

1.2 试药 黄芪甲苷对照品、盐酸小檗碱对照品、金银花对照药材、绿原酸对照品、麦冬对照药材、原儿茶醛对照品、五味子乙素对照品(中国药品生物制品检定所提供),甲醇、乙腈均为色谱纯,其他试剂均为分析纯。益心解毒颗粒由山东步长制药有限公司生产提供。

2 方法与结果 2.1 薄层层析定性鉴别 2.1.1 麦冬的薄层鉴别:取本品 6g,加水 30m L,加热使溶解,加入 1.5m L盐酸,加热煮沸 10min,放冷,加水补足至 30m L,加氯仿提取 3次,每次 30m L,合并提取液,浓缩至约 2m L,作为供试品溶液;另取麦冬对照药材 2g,加水30m L,煎煮 20min,滤过,滤液加盐酸0.5m L,同法制成对照药材溶液;照薄层色谱法(中国药典 2010年版一部附录ⅥB)试验,吸取供试品溶液 4μL,对照药材溶液8μL,分别点于同一硅胶G薄层板上,以氯仿-丙酮 (7:1)为展开剂,展开,取出,晾干,喷以 10%硫酸乙醇溶液,在105℃加热至斑点显色清晰,供试品色谱中,在与对照药材色谱相应的位置上显相同颜色的主斑点,而阴性无干扰。

2.1.2 金银花的薄层鉴别:取本品 4g,加水30m L,加热使溶解,放冷 ,加盐酸调 p H值=1～ 2,用醋酸乙酯提取 3次,每次 15m L,合并醋酸乙酯提取液,蒸干,残渣加甲醇 5m L使溶解,作为供试品溶液;另取金银花对照药材 0.5g,加甲醇 15m L,超声处理 20min,滤过,滤液蒸干,残渣加甲醇5m L使溶解,作为对照药材溶液;再取绿原酸对照品,加甲醇制成每 1m L含 1mg的溶液,作为对照品溶液;照薄层色谱法(中国药典 2010年版一部附录ⅥB)试验,吸取供试品溶液5μL,对照药材溶液 3μL,对照品溶液 2μL,分别点于同一聚酰胺薄膜上,以 25%冰醋酸溶液为展开剂 (展距 6cm),展开,取出,晾干,置紫外光灯(365nm)下检视,供试品色谱中,分别在与对照品色谱及对照药材色谱相应的位置上,显相同颜色的荧光斑点,而阴性无干扰。

2.1.3 黄连的薄层鉴别:取本品 1g,加乙醇20m L,超声处理 20min,滤过,滤液蒸干,残渣加甲醇5m l使溶解,作为供试品溶液;另取黄连对照药材 0.5g,同法制成对照药材溶液;再取盐酸小檗碱对照品,加甲醇制成每 1m L含 0.5mg的溶液,作为对照品溶液;照薄层色谱法(中国药典 2010年版一部附录ⅥB)试验,吸取上述三种溶液各 5μL,分别点于同一硅胶 G薄层板上,以正丁醇-冰醋酸-水(7∶ 1∶2)为展开剂,展开,取出,晾干,置紫外光灯(365nm)下检视,供试品色谱中,在与对照药材及对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的荧光斑点,而阴性无干扰。

2.1.4 五味子的薄层鉴别:取本品 10g,加水40m L,加热使溶解,放冷,用水饱和的乙醚提取 2次,每次 20m L,合并提取液,挥去乙醚,残渣加醋酸乙酯2m L使溶解,作为供试品溶液;另取五味子乙素对照品,加醋酸乙酯制成每 1m L含 1m g的溶液,作为对照品溶液;照薄层色谱法(中国药典 2010年版一部附录ⅥB)试验,吸取供试品溶液 10μL,对照品溶液 4μL,分别点于同一硅胶GF254薄层板上,以甲苯-醋酸乙酯(9∶1)为展开剂,展开,取出,晾干,置紫外光灯(254nm)下检视。供试品色谱中,在与对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点,而阴性无干扰。

2.1.5 丹参的薄层鉴别:取本品8g,加盐酸溶液(5→100)40m L,水浴加热 1h,用水饱和的乙醚提取 2次,每次 40m L,合并乙醚液,回收乙醚至约 15m L,用2%碳酸钠水溶液洗涤 2次,每次 10m L,合并碱液,加盐酸调 PH值至 2,用水饱和的乙醚提取 3次,每次15m L,合并提取液,挥干,残渣加甲醇 2m L使溶解,作为供试品溶液;另取原儿茶醛对照品,加甲醇制成每1m L含 0.5mg的溶液,作为对照品溶液。照薄层色谱法(中国药典 2010年版一部附录ⅥB)试验,吸取供试品溶液 10μL,对照品溶液 2μL,分别点于同一硅胶 G薄层板上,以甲苯-醋酸乙酯-甲酸 (15∶ 10∶1)为展开剂,展开,取出,晾干,喷以新鲜配制的 1%间苯三酚乙醇-浓硫酸 (1∶ 1)的混合溶液,供试品色谱中,在与对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点,而阴性无干扰。

2.2 黄芪甲苷含量测定 2.2.1 色谱条件:色谱柱:Kromosil ODSC18(5μm,4.6mm×250mm);流动相:乙腈 -水 (32∶ 68);柱温:40℃;流速 ,1.2m L/min;漂移管温度:105℃;载气流量:2.5L◦ min-1;放大系数:1[1]。

2.2.2 对照品溶液的制备:取黄芪甲苷对照品适量,加甲醇制成每 1m L含 0.5mg的溶液,作为对照品溶液。

2.2.3 供试品溶液的制备:精确称取益心解毒颗粒约 10g,置于锥形瓶中,加入甲醇 50m L,超声处理30min,滤过,弃去初滤液,精密移取续滤液 25m L,水浴蒸干,残渣加水20m L溶解,并用石油醚萃取 4次,每次10m L,弃去石油醚层,水层挥发至无醚味;继续用饱和正丁醇萃取 3次,每次 10m L,合并正丁醇提取液,用1%的氢氧化钠溶液洗涤3次,每次15m L,弃去氢氧化钠溶液,将正丁醇溶液蒸干,残渣加入 4m L甲醇溶解,并用 0.45μm微孔滤膜滤过,即得。

2.2.4 空白试验:阴性对照的制备:以处方中药味比例和制备工艺制成不含白芍的空白样品,再按供试品制备方法处理,制成阴性对照溶液。吸取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照品溶液 10μL注入液相色谱仪,依法测定。结果对照品溶液与供试品溶液在相同的保留时间有相应的峰,而阴性对照没有。说明测定的专属性好、无干扰。

2.2.5 标准曲线的绘制:分别精密吸取黄芪甲苷对照品溶液 (浓度 0.48mg/m l)2、 4、6、8、10μL,按上述色谱条件注入色谱仪,以峰面积为纵坐标,黄芪甲苷进样量(μg)为横坐标绘制标准曲线,回归方程为 Y=1215244X+25631.3,相关系数 r=0.9998,黄芪甲苷在 0.96μg～ 4.8μg之间有良好的线性关系。

2.2.6 精密度试验:取黄芪甲苷对照品溶液,重复进样6次,记录峰面积,结果 RSD为0.3%,表明本方法精密度良好。

2.2.7 重复性试验:取本品适量,共 6份,照“2.2.3”项下的方法制备供试品溶液,分别精密取 10μL进样,在上述色谱条件下测得样品,RSD为 1.36%,结果表明此方法重复性良好。

2.2.8 加样回收率试验:采取加样回收法,取一定量已知含量的样品 6份,分别加入黄芪甲苷对照品适量,照“2.2.3”项下的方法制备供试品溶液,在上述色谱条件下测定含量,计算回收率(见表1)。

表1 回收率实验结果

2.2.9 稳定性试验:精密取本品适量,照“2.2.3”项下的方法制备供试品溶液 ,分别于 0、 2、 4、 8、 12、24h进样,记录峰面积,结果 RSD为 1.38%,表明供试品在24h内稳定性良好。

2.2.10 样品的含量测定:取本品 3批样(10g/袋),照“2.2.3”项下的方法制备供试品溶液,依上述色谱条件测定,其中含黄芪甲苷的最高为 1.38mg/袋,最低为 1.21 mg/袋,考虑到药材的来源,参考其他黄芪制剂含量限量,暂定本品每袋含黄芪以黄芪甲苷计,不得少于1.20mg,并规定本品所用黄芪药材含黄芪甲苷按《中国药典》2010年版一部黄芪项下有关规定执行。

3 小结与讨论 在薄层鉴别研究中[1],我们曾对处方中地黄、防风和酸枣仁进行鉴别,根据药典和文献报道的方法进行了供试品溶液的制备,由于处方中所含化学成分种类多,性质相似,通过采用多种方法进行了探讨,但均未获得满意的结果,无法得到稳定的薄层鉴别方法,故均未收入标准正文。

目前,有关黄芪甲苷含量测定的方法已有不少报道[2,3,4],多采用薄层扫描法、比色法等。益心解毒颗粒中除君药黄芪外,还有炙甘草等药材均含有较多皂苷类成分,会严重干扰黄芪甲苷的测定。为此,我们在实验中采用多种供试品制备方法以及多种色谱条件的尝试,最终确定了本实验中所述的最佳条件。

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典 [M].北京:化学工业出版社,2010.

[2] 王 宝 ,苏 健,鲁 静.黄芪甲大甙的检测在中药质控中的应用[J].中国中药杂志,1996,21(3):161-164.

[3] 龙恩武,张一萍.黄芪及其制剂中黄芪甲苷测定方法研究进展 [J].时珍国医国药 ,2000,11(9):854-855.

[4] 李 江 ,李颖倩.黄芪甲甙分析方法研究概况 [J].北京中医,2000,19(4):50-51.