参仙生脉口服液 HPLC指纹图谱研究

杨娟英 林玉红 谢 伟 王月茹 陕西步长制药有限公司 (西安 710075)

参仙生脉口服液是由红参、淫羊藿、枸杞子、补骨脂等药材组成,具有温补心肾,活血化瘀之功效。用于阳虚脉迟症,症见脉迟、脉结、心悸、胸闷、胃寒肢冷、腰膝酸软、气短乏力等症,对于现代医学中病窦综合症及窦性心动过缓等类型心律失常具有良好的治疗效果。由于该制剂涉及的药材种类较多、化学成分相对复杂,各味药材易受产地、药用部位、采收时间、提取工艺等因素的影响,为有效的控制及评价该制剂的质量带来了一定的困难。指纹图谱反映的是样品整体的特征的质量评价方法[1、2],本试验拟建立该制剂的中药高效液相色谱(HPLC)指纹图谱。实验中采用全波长检测法,最终建立了参仙生脉口服液 HPLC指纹图谱,为科学、合理的评价及有效的控制该制剂的质量提供了可行的参考方法。

1 仪器与试药 1.1 仪 器 Waters 2695高效液相色谱仪,Empow er色谱工作站,2996二极管阵列检测器;HB3120U型数控超声波发生器;Sartorius BT125D电子天平。

1.2 试 药 人参皂苷 Rg1对照品,人参皂苷Rb1对照品,淫羊藿苷对照品(中国药品生物制品检定所提供);参仙生脉口服液 10批(批号 100302,100303,100304,100601,100602,100603,101201,101202,101203,101204)由山东步长制药有限公司生产提供;甲醇、乙腈均为色谱纯,其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果 2.1 色谱条件 色谱柱:K romosilODSC18(5μm,4.6mm× 250mm);流动相:乙腈 (A)-水(B)梯度洗脱:0～ 20min(A:10%→20%),20～ 40min(A:20%→ 30%),40～ 65min(A:30%→38%);全波长检测;柱温:30℃;流速,1.0m L/min。

2.2 对照品溶液的制备 取人参皂苷 Rg1、人参皂苷 Rb1、淫羊藿苷对照品适量,至于量瓶中,加甲醇制成每 1m L含 0.5mg的溶液,作为混合对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备 精密量取本品 10m L,用D101型大孔吸附树脂柱吸附,然后用100m L蒸馏水洗脱,弃去水洗液;用 70%乙醇 50m L洗脱,收集洗脱液,蒸干,残渣加甲醇适量使溶解,并转移至5m L量瓶中定容,用 0.45μm的微孔滤膜过滤,取续滤液,即得。

2.4 测定方法及数据处理 精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μL,进样,记录120min的色谱图,采用国家药典会推荐的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004A版)”,经过数据导入,点校正和数据匹配,将多个批次的样品色谱图进行比较,得到可全面反映多个色谱图特征的参仙生脉口服液的对照指纹图谱,根据峰匹配结果,以峰面积为参数,计算出各样品指纹图谱与对照指纹图谱(R)的整体相似度,结果越接近1即相似度越高。

2.5 稳定性、精密度和重复性考察 取同批样品,按照“2.2.3”项方法制备供试品溶液 ,分别在 0、 2、4、 6、 8、 10、 12、 24h时测定 ,观察各峰的 tR、峰面积比值的变化及图谱的相似度。结果表明:各共有峰的 tR、峰面积的比值及色谱相似度基本稳定(RSD＜2.0,相似度为＜0.920),符合指纹图谱制定的要求;取同一批样品 6份,按照“2.2.3”项方法制备供试品溶液,测定指纹图谱;6次测定结果稳定,各共有峰的 tR、峰面积的比值及色谱相似度基本一致(RSD＜1.21,相似度 ＜0.990)。以上实验结果表明:本方法的稳定性、精密度和重复性良好。

2.6 共有指纹峰的标定和相似度的计算 取 10批复方红景天口服液样品,分别按照“2.2.3”项方法制备供试品溶液,在上述色谱条件下,测定其色谱图,结果见图 1、2和附表。

图110 批参仙生脉口服液HPLC指纹图谱

图2 参仙生脉口服液HPLC对照指纹图谱

附表10批参仙生脉口服液 HPLC指纹图谱相似度计算结果

3 讨 论 目前,中药制剂 HPLC指纹图谱多以单一波长下指纹图谱为依据,不能同时反映特征吸收波长不同的多指标成分的化学信息。为了能更深入的反映本检测样品指纹信息的整体性、特征性,更全面的控制该制剂的质量,本试验采用全波长检测法对待测样品的指纹图谱进行考察,结果发现在254nm处样品信息较为全面,并且峰形好,分离度高,响应值较大。

相似度是聚类分析中的一个基本概念[3、4],它反映了研究对象之间的亲疏程度,聚类分析就是根据研究对象之间的相似性来进行分类的。在聚类分析技术的发展过程中,形成了很多种测度相似性的方法。其中距离测度的出发点是把每个案例看作 m维空间中的一个点,在 m维空间中定义点与点之间的距离,距离越近的点,相似程度越高,聚类时更可能归为一类。指纹图谱反映的是样品整体的特征,进行指纹图谱的比较,可以反应样品之间的亲疏程度,但是单纯的直观比较指纹图谱的峰的多少和峰的大小,只是定性比较,而且又带有个人的主观性。相似度可以定量地描述指纹图谱,本实验中用相似度分析软件对参仙生脉口服液 10个批次进行比较,根据其色谱指纹图谱建立对照指纹图谱(共有模式),计算样品与对照指纹图谱的相似度算结果均在0.99以上,RSD为0.3%,并且对各色谱图进行色谱峰匹配,结果初步确立了10个共有峰,其中 3个已标定,因此我们将在今后的研究过程中,继续确定其他共有峰的归属,这将为本产品的质量评价的提高提供基础和依据。

[1] 张 聪 ,王智华,金德庄.中国红参与高丽红参的指纹谱比较研究 [J].中成药 ,2001,27(3):160-163.

[2] 赵陆华,屠 颖,吴孟华,等.肾宝合剂 HPLC指纹图谱的研究[J].中国药科大学学报,2005,36(2):134-136.

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