前房相关免疫偏离中调节性T细胞的变化

张敏敏，张晓敏，赵少贞

（天津医科大学眼科中心屈光角膜科，天津300384）

前房相关免疫偏离（anterior chamber-associated immune deviation,ACAID）是指在前房种植抗原后所激发的一种独特的偏离式免疫反应，表现为（1）抗原特异性介导迟发型超敏反应（deleyed-type hypersensitivity,DTH）的T细胞和分泌补体固定性抗体反应的抑制；（2）保留了细胞毒T细胞和分泌非补体固定性抗体的B细胞反应；（3）还产生了抑制DTH诱导和表达的调节性T细胞[1]。这一机制对防止眼球受到炎症反应的损害和维持眼内免疫赦免微环境非常重要。Foxp3是转录因子叉头样/翼状螺旋家族(forkhead/winged-helix)的成员[2]，其编码基因位于X染色体。实验表明，Foxp3分子是赋予调节性T细胞抑制功能的主要分子，也是在啮齿类和人类CD4+和CD8+调节性T细胞群的标志性特征。Foxp3的异位表达可以将抑制活性转移给某些非调节性T细胞[3]。CD4+CD25+Foxp3+T细胞，CD8+Foxp3+T细胞都是调节性T细胞，在其他免疫反应中均有明显的抑制调节作用。本实验旨在研究CD4+CD25+Foxp3+T细胞、CD8+Foxp3+T细胞在ACAID形成机制中的变化。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及动物 C57BL/6小鼠（SPF级）30只，雌性，体重18~20 g，6~8周龄，购自北京大学医学部实验动物部[SCXK（京）2006-0008]，饲养在天津医科大学实验动物中心。卵白蛋白（OVA）和完全弗氏佐剂（complete Freund’s adjuvant,CFA）购自美国Sigma公司。FITC标记的抗小鼠CD3，PE标记的抗小鼠CD4，PE-Cy7标记的抗小鼠CD25，PE标记的抗小鼠CD8a，APC标记的Foxp3和大鼠IgG1，破膜透化液均购自美国eBioscience公司。小鼠淋巴细胞分离液购自灏洋生物公司。流式分析仪三通阀及螺口注射器购自美国BD公司。工程游标卡尺购自桂林广陆数字测控股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 ACAID的常规诱导[4]将小鼠随机分为3组，ACAID组、阳性对照组和正常对照组，每组各10只。ACAID组采用水合氯醛腹腔注射法麻醉小鼠，然后在手术显微镜下，用微量注射器于右眼颞上象限角巩膜缘内1 mm前房穿刺，抽取房水（2 μL），再循原孔接种2 μL OVA溶液（50 mg/mL）。阳性对照组和正常组原孔接种2 μL无菌PBS溶液。ACAID组和阳性对照组于7 d后将100 μL 2.5%OVA溶液与等体积CFA充分混合乳化，总体积为0.2 mL，皮下注射于小鼠右后足垫内免疫动物。14 d后用工程游标卡尺（精确度为0.01 mm）测量3组双耳廓厚度，然后于小鼠左耳廓皮内注射20 μL无菌PBS溶液，右耳廓皮内注射20 μL OVA溶液(20 mg/mL)。24 h后，再用工程游标卡尺测量3组双耳廓厚度，按照下述公式计算耳廓肿胀数值。迟发型超敏反应耳廓肿胀数值=（24 h右耳廓厚度值-0 h右耳廓厚度值）-（24 h左耳廓厚度值-0 h左耳廓厚度值）（μm）

1.2.2 流式检测CD4+CD25+Foxp3+T细胞和CD8+Foxp3+T细胞数量[5]在ACAID组前房注射抗原后第15天，对各组小鼠断髓处死，无菌取出脾脏，加淋巴细胞分离液密度梯度分离法分离淋巴细胞，制备单细胞悬液，取1×106/100 μL细胞加入FITC标记抗小鼠CD3抗体，PE标记抗小鼠CD4抗体，PECy7标记抗小鼠CD25抗体于4℃反应30 min，洗细胞，加破膜透化液固定和破膜，4℃反应1 h。加入APC标记抗小鼠Foxp3抗体4℃反应30 min，洗细胞重悬后上机进行流式检测。APC标记大鼠IgG1作为同型对照。另备1×106/100 μL细胞加入FITC标记抗小鼠CD3抗体和PE标记抗小鼠CD8抗体和APC标记Foxp3抗体及同型对照，反应步骤同上。分别用CD3+CD4+，CD3+CD8+设门，分析CD4+CD25+Foxp3+T细胞在CD4+T细胞中的比例，CD8+Foxp3+T细胞在CD8+T细胞中的比例。

1.3 统计学方法 利用SPSS13.0软件系统进行分析，应用方差分析检验3组小鼠耳廓肿胀值、CD4+CD25+Foxp3+T细胞在CD4+T细胞的比例、CD8+Foxp3+T细胞在CD8+T细胞的比例的差异，以P<0.05为有统计学意义。

2 结果

2.1 DTH测量结果 前房注射OVA抗原的小鼠耳廓肿胀程度远远小于阳性对照组（表1），说明ACAID形成。

表1 OVA诱导的小鼠耳廓肿胀反应数值Tab 1 Ear swelling measurement induced by OVA

2.2 CD4+CD25+Foxp3+T细胞数量 在ACAID组，小鼠脾脏中CD4+CD25+Foxp3+T细胞占CD4+T细胞总量的8.18%，和阳性对照组及正常对照组相比均有显著性差异（P<0.05），见图1。

2.3 CD8+Foxp3+T细胞数量 ACAID组小鼠的CD8+Foxp3+T细胞占CD8+T细胞的2.12%，和阳性对照组及正常对照组相比均有显著性差异（P<0.05），见图2。

图1 CD4+CD25+Foxp3+T细胞在CD4+T细胞中的比例（*P<0.05）Fig 1 The percentage of CD4+CD25+Foxp3+T cell in CD4+T cell

图2 CD8+Foxp3+T细胞在CD8+T细胞中的比例（*P<0.05）Fig 2The percentage of CD8+Foxp3+T cell in CD8+T cel（l*P<0.05）

3 讨论

本实验采取的是OVA可溶性抗原进行ACAID模型的制备，可引起ACAID反应的抗原有可溶性抗原[小牛血清白蛋白（BSA）、OVA、视网膜S抗原、光感受器间维生素A类结合蛋白（IRBP）]、半抗原、病毒编码的抗原（单纯疱疹病毒）和细胞表面分子（组织相容性抗原、特殊肿瘤抗原），而无活性的颗粒性抗原不能诱导ACAID[6]。DTH结果显示，本研究前房相关免疫偏离模型制作是成功的，为接下来准确测定调节性T细胞的变化提供了基础。

为了排除前房注射引起的影响，笔者对阳性对照组和正常对照组予前房注射PBS。结果显示ACAID组和阳性对照组及正常对照组相比在CD4+CD25+Foxp3+T细胞和CD8+Foxp3+T细胞数量之间均有显著差异，而阳性对照组和正常对照组之间在CD4+CD25+Foxp3+T细胞和CD8+Foxp3+T细胞数量之间没有区别。结果提示，ACAID中Foxp3的表达增加是其本质特征，并不是由于前房注射引起的并发结果。

CD4+CD25+调节性T细胞对外周免疫耐受的诱导和维持起到很重要的作用。而Foxp3是CD4+CD25+调节性T细胞的特征标志[7]。Keino等[8]研究显示了在ACAID中Foxp3在CD4+CD25+调节性T细胞上的表达。本实验进一步证明ACAID脾细胞中CD4+CD25+Foxp3+T细胞的比例较阳性对照组和正常组升高。有研究认为，CD4+CD25+Foxp3+T细胞不是直接抑制DTH反应，而是对ACAID的信号传入阶段起抑制作用。但是其在ACAID中的确切机制还不清楚，需要进一步探索。然而ACAID的诱导不依赖天然CD4+CD25+调节性T细胞，天然CD4+CD25+T细胞是在正常小鼠胸腺自发产生的，ACAID产生的调节性传入性T细胞与天然CD4+CD25+调节性T细胞有许多相似性，因为它们都表达CD4。ACAID调节性T细胞，尤其是CD4+传入性T细胞，可以从CD25-的T细胞前体转化来。有实验显示，CD4+CD25-的T细胞，能够稳定地转化为CD4+CD25+调节性T细胞，并伴随Foxp3表达；在体外，T细胞与经OVA和TGF-β2处理过的APC共培养后也表达CD25。因此，调节性T细胞上CD25+的表达，与天然CD4+CD25+T细胞在功能上和来源上都没有联系，体内ACAID的诱导，不依赖天然CD4+CD25+细胞的存在[8]。

在本研究中，笔者证明了ACAID中脾脏CD8+T细胞中Foxp3的表达增加。已经有实验证明，CD8+调节性T细胞在ACAID的抑制DTH表达过程是很重要的[9]。然而，这类细胞群亚型还不太明确。为了进一步研究这种细胞群，本实验研究了CD8+T细胞在脾脏细胞中的比例。Mc Kenna等[10]发现前房注入可溶性抗原能够诱导抗原特异性CD8+T细胞的扩增。进一步的研究，用过继转移的方法揭示出这群细胞的抑制活性。结果显示ACAID小鼠脾脏中的CD8+T细胞能够抑制已接触抗原的T细胞介导的耳廓迟发型超敏反应。说明ACAID小鼠脾脏中CD8+T细胞中存在传出性抑制细胞。另有实验研究ACAID中CD8+T细胞Foxp3在mRNA水平和蛋白水平的表达，结果显示当细胞多克隆刺激后CD8+T细胞的Foxp3的表达无论在mRNA水平和蛋白水平都上调了[11]。提示在ACAID小鼠体内存在CD8+Foxp3+T细胞群。而我们的实验证明，在ACAID中CD8+Foxp3+T细胞数量增加，很可能就是这一类ACAID中具有抑制DTH作用的CD8+T细胞，而Foxp3的表达可能是CD8+传出性调节性T细胞的特性。

CD8+T细胞上Foxp3的表达也在另外一个免疫耐受模型（狼疮小鼠）中研究过[12]，Hahn等把人工合成的多肽静脉注射进这些小鼠体内，发现CD8+T细胞上有Foxp3的表达。这些研究成果都证明了CD8+调节性T细胞上Foxp3表达的增加可能在经前房或者经静脉的免疫耐受表达中扮演了非常重要的作用。然而，其在ACAID中的确切作用还有待进一步探索。

综上所述，我们认为至少有两种不同功能的调节性T细胞在ACAID的发展中起作用。他们可能分别在ACAID的不同阶段发挥了作用，进而抑制DTH。虽然ACAID的研究目前取得了一定的进展，但要从根本上理顺和解释ACAID的发生机制，还需要进行大量的深入研究。

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