黄芪甲苷对兔脂肪来源的间充质干细胞体外增殖和细胞周期的影响

何文涓，何晓升，袁志坚，张兰芳

(1.无锡卫生高等职业技术学校，江苏 无锡 214028;2.杭州师范大学 临床医学院，浙江 杭州 310036)

黄芪含有黄芪甲苷、多糖、黄酮、单糖、生物碱、叶酸、多种氨基酸等有效成分，具有提高免疫机体免疫功能，抗衰老等作用［1］。我们前文研究了黄芪多糖对兔脂肪来源的间充质干细胞(ASCs)体外增殖的作用［2］。本研究观察了黄芪甲苷对兔脂肪来源的ASCs的周期和体外增殖的作用。

1 材料

黄芪甲苷(含量98%，批号:TCM067-110724)，南京替斯艾么中药研究所;DMEM培养基及胎牛血清，美国Gibo公司;四甲基偶氮唑盐(MTT)和碘化丙啶(PI)，美国Sigma公司;抗体CD14，美国Caltag公司;CD29，美国Chemcon公司;CD44，美国Chemcon公司;CD45，美国Antigenix公司。

流式细胞仪，美国BD公司;3350型自动酶联免疫检测仪，美国Beckman公司;TY6731台式冷冻离心机，美国Beckman公司。

2 方法

2.1 兔脂肪来源的ASCs的培养和表型鉴定

按文献［2］方法进行。

2.2 分组及培养

选取生长良好的第3代传代细胞，用0.25%胰蛋白酶消化，制成细胞悬液，将浓度调至2×109/L，接种于96培养板中。置于培养箱中培养24 h。

随机设置对照组、空白组和实验组。对照组仅加培养液，空白组不加培养液，实验组按设定的实验方案依次加入含有不同浓度黄芪甲苷溶液的培养液。再培养24 h，在倒置显微镜下观察细胞形态，计算细胞数。

2.3 流式细胞仪检测细胞周期

取2.2项下培养24 h后的其中一组细胞液(黄芪甲苷浓度为2.5 mg/L)，收获细胞，将浓度调为5×107/L，在4℃下用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤一次，75%乙醇20℃固定过夜;然后再用PBS洗涤一次，离心，弃上清，加 PC缓冲液100 μL，37℃水浴间断振荡30 min，加10 mg/mL RNAse 10 μL及50 mg/mL PI溶液 490 μL，室温避光 30 min，用流式细胞仪检测细胞周期。

2.4 MTT比色法检测细胞的增殖

其余各组细胞液培养48 h之后，取出对照组、空白组以及各浓度的黄芪甲苷实验组的细胞，分别将细胞液浓度调为5×107/L，再分别将各孔细胞培养液转接种于96孔细胞培养板中，每孔含细胞悬液100 μL，每孔加入 5 mg/mL MTT 溶液 20 μL，在37℃、5%CO2条件下继续培养4 h，终止培养后弃上清液。每孔加入二甲基亚砜(DMSO)150 μL，振荡混匀，充分溶解残留的MTT结晶物后，用酶联免疫检测仪测定570 nm波长处的吸光度(A)值。

2.5 统计学处理

3 结果

3.1 流式细胞仪表型分析结果

用第3代ASCs检测后，显示CD29和CD44为阳性，而CD14和CD45为阴性。

3.2 不同浓度黄芪甲苷对细胞增殖的作用

倒置显微镜下见各实验组细胞增多，未见坏死迹象，对照组细胞形态正常。由表1可见，黄芪甲苷浓度在0.019 5 mg/L 时，A 值为(1.183 ±0.056);黄芪甲苷溶液在0.039 1～10 mg/L浓度范围内，实验组 A 值为(1.912±0.067)～(2.135 ±0.168)，对照组为(1.135±0.080)。表明黄芪甲苷极低浓度(0.019 5 mg/L)时，对ASCs无明显促进增殖的作用(P ＞0.05);而黄芪甲苷浓度在0.039 1～10 mg/L 范围时，对ASCs均有明显促进增殖的作用(P＜0.01)。另外还可发现，当黄芪甲苷浓度达一定值后，对ASCs的增殖作用不随浓度的增加而增加。

表1 不同浓度黄芪甲苷对ASCs增殖的影响(± s，n=4)Tab.1 The result of different concentrations of Astragaloside on proliferation of rabbit ASCs in vitro(± s，n=4)

表1 不同浓度黄芪甲苷对ASCs增殖的影响(± s，n=4)Tab.1 The result of different concentrations of Astragaloside on proliferation of rabbit ASCs in vitro(± s，n=4)

与对照组比较:1P＜0.01Compared with control group:1P ＜0.01

组 别 浓度/(mg/mL) A值空白组 －0.057 ±0.001对照组 － 1.135±0.080黄芪甲苷组 0.019 5 1.183 ±0.056 0.039 1 1.912 ±0.0671 0.078 1 2.244 ±0.1331 0.156 2 2.080 ±0.0671 0.312 5 2.118 ±0.2201 0.625 2.125 ±0.0951 1.25 2.140 ±0.1131 2.5 2.072 ±0.1561 5 2.161 ±0.0361 10 2.135 ±0.1681

3.3 细胞周期的检测结果

对培养24 h的、加浓度为2.5 mg/L黄芪甲苷溶液的细胞液进行细胞周期分析，流式细胞仪细胞周期分析显示，多数细胞处于增殖状态(G2、S和M期)，处于增殖期的细胞占细胞总数的61.2%，分布在静止期(G0、G1期)的约占总数的35.1%;而经过黄芪甲苷作用后，处于增殖期的细胞明显增多，占总数的72.9%，分布于静止期的相应明显减少，与对照组比较，差异有统计学意义(P＜0.01)。

4 讨论

本研究观察到，培养24 h后，浓度为2.5 mg/L黄芪甲苷对ASCs的周期有明显的影响，与对照组比较，显著地促进细胞进入增殖期(P＜0.05);48 h细胞增殖情况，与对照组相比黄芪甲苷浓度为0.019 5 mg/L时，对ASCs无明显促进增殖的作用，黄芪甲苷浓度在0.0391～10 mg/L范围内，对ASCs均有明显增殖作用，并表现出在该浓度范围内，黄芪甲苷对ASCs的增殖作用不随浓度的增加而增加。因此，在一定浓度范围内，黄芪甲苷对ASCs的增殖有明显促进作用。

近年来，很多研究者在黄芪甲苷对各种干细胞增殖作用的研究中取得了不少进展。如柴丽娟等［3］研究表明，黄芪甲苷对神经干细胞(NSCs)的增殖具有明显的诱导作用，其可能通过上调与细胞增殖相关基因Hesl、Hes5、cyclinD1表达而起作用，但也可能调节与其它增殖通路有关。王畅等［4］研究表明，黄芪甲苷能够促进海马区神经干细胞增殖、分化，很可能与其上调NGF mRNA表达有关。廖联明等［5］研究发现，黄芪甲苷诱导脐带血间充质干细胞分化为心肌样细胞，表达心肌特异性蛋白。王曦等［6］研究结果是，黄芪甲苷在较低浓度(5 ～20 μg/mL)时，可促进皱纹和无皱纹皮肤成纤维细胞增殖，促进皱纹、无皱纹和老年成纤维细胞Ⅰ型胶蛋白合成，降低皱纹和无皱纹皮肤成纤维凋亡率。

我们曾对黄芪多糖注射液及黄芪注射液对兔脂肪来源的ASCs的体外增殖进行了研究，结果表明低浓度黄芪多糖对ASCs的增殖无促进作用，也无抑制作用，较高浓度的黄芪多糖对ASCs的增殖有抑制作用［3］;而不同浓度黄芪注射液对ASCs的体外增殖均有明显的促进作用，我们认为黄芪注射液对ASCs的体外增殖的促进作用应该是黄芪甲苷的作用，本实验结果证明，黄芪甲苷对ASCs的体外增殖确有明显促进作用。

干细胞具有非凡的再生能力，利用干细胞技术，可以再造多种人体组织器官，甚至更年轻的组织器官。脂肪来源的ASCs的增殖研究，比骨髓干细胞及人胚胎干细胞的增殖的研究更具现实意义，其来源广泛，取材方便，且一旦用于临床，患者更容易接受。钟晓春等［7］的研究表明，ASCs加入颗粒脂肪组织中进行游离移植，可以取得更好的移植效果，将为临床脂肪移植提供一个新方法。因此，黄芪甲苷对脂肪来源的ASCs增殖的促进作用将在脂肪移植、疤痕修复以及美容整形等方面有更广泛的应用前景，值得进一步研究探索。

［1］刘维统，王 跃，郝 鹏，等.黄芪甲苷对关节软骨细胞功能影响的实验研究［J］.实用医院临床杂志，2009，6(4):44-47.

［2］何文涓，张兰芳，袁志坚，等.黄芪多糖对兔脂肪来源的间充质干细胞体外增殖的影响［J］.中国生化药物杂志，2011，32(5):387-389.

［3］柴丽娟，钟佩茹，周志焕，等.黄芪甲苷对体外神经干细胞增殖作用影响的研究［J］.中国药理学通报，2010，26(5):670-673.

［4］王 畅，张艳军，冯 英，等.黄芪甲苷对短暂性前脑缺血模型大鼠海马神经再生的影响［J］.中草药，2009，40(5):754-758.

［5］廖联明，郑友生，江 敏，等.黄芪甲苷促进脐带血干细胞向心肌细胞分化作用的研究［J］.福建医药杂志，2011，33(1):1-4.

［6］王 曦，石 钰，Viennet C，等.黄芪甲苷对人皮肤成纤维细胞增值和凋亡的作用［J］.中华医学美学美容杂志，2006，12(2):93-97.

［7］钟晓春，倪有娣，何晓升.脂肪来源间充质干细胞对颗粒状脂肪组织移植效果的影响［J］.健康研究，2009，29(6):419-421.