PAR-2在人胰腺癌细胞中的表达及吉西他滨的干预作用

刘 星 胡煜辉 肖游章 张晓春 周 青 徐建华 肖 凤 罗友根 李晓飞

(井冈山大学医学院重点实验室，江西 吉安 343000)

最新研究表明，蛋白酶激活受体-2(proteinase activated receptor-2，PAR-2)与恶性肿瘤的增殖、侵袭转移密切相关〔1〕。其他文献也认为PAR-2能被其内源激活剂胰蛋白酶激活，从而影响组织功能〔2〕。综合以上各种研究结果，笔者推测PAR-2在人胰腺癌细胞中具有很高的表达，而基于PAR-2相关的胰腺癌的治疗方案也必将成为新的研究热点。目前，吉西他滨是治疗胰腺癌的首选药物〔3〕。本研究拟从肿瘤病理学及分子生物学的最新理论出发，旨在研究PAR-2在人胰腺癌细胞中的表达态势，并通过RT-PCR观察吉西他滨对胰腺癌细胞中PAR-2表达的影响，初步探讨吉西他滨治疗胰腺癌的可能机制，为临床应用提供实验依据，同时也为胰腺癌基因靶向治疗的进一步研究奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株 人胰腺癌细胞株PANC-1购于中科院上海生物化学与细胞生物学研究所。

1.1.2 仪器与试剂 TRIzol Reagent(Invitrogen公司);逆转录和qPCR所用试剂分别为RevertAid First Strand cDNA synthesis Kit(Fermentas公司)，Platinum SYBR Green qPCR SuperMix-UDG(Invitrogen公司);DEPC水(Invitrogen公司);高糖DMEM(GIBCO公司);胎牛血清(兰州民海生物工程有限公司)。定量PCR仪:BIO-RAD MJ Mini Opticon Real-Time PCR System，配套使用的软件为BIO-RAD CFX Manager;双人双面垂直净化工作台(苏州净化设备有限公司);二氧化碳培养箱(Thermo公司);高速低温离心机(Eppendorf公司);PAR-2引物由上海华大基因合成。注射用盐酸吉西他滨(商品名:泽菲，江苏豪森药业，国药准字H20030105)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及分组 人胰腺癌细胞株PANC-1培养选用含有10%新生牛血清的DMEM，置37℃、95%湿度、5%CO2的培养箱培养，待细胞长满25 cm2培养瓶底部70% ～80%时，消化传代，取对数生长期细胞用于实验，按105个/孔接种于6孔培养板，并分为:cancer组(胰腺癌细胞阳性对照组)、Gao组(高剂量干预，吉西他滨给药浓度50 μg/ml)、Zhong组(中剂量干预，吉西他滨给药浓度5 μg/ml)、Di组(低剂量干预，吉西他滨给药浓度0.5 μg/ml)，每个剂量设3个复孔。贴壁过夜后，用无血清DMEM同步化24 h，再给药24 h，按试剂盒要求提取总RNA，逆转录后超低温冰箱保存备用。取各组细胞分别进行基因扩增，以内参对照。正常胰腺组织取自南昌市第二医院，设为normal组(正常胰腺组织阴性对照组):液氮研磨后，提取总RNA，按试剂盒要求逆转录后进行基因扩增。

1.2.2 逆转录聚合酶链反应(RT-PCR) 采用RNA分离试剂盒TRIzol提取并纯化细胞总RNA;所有RNA样本浓度均稀释至1 g/L，用逆转录试剂盒进行逆转录，均按说明书进行。(1)RT-PCR引物序列见表1，GAPDH基因的 PCR产物大小为88 bp，PAR-2基因的PCR产物大小为222 bp。(2)PCR扩增反应体系:Mix 12.5 μl;SYBR Green I 5.0 μl;正向引物 1 μl;反向引物 1 μl;ddH2O 4.5 μl;cDNA 1 μl。(3)反应条件 Protocol:1:95.0℃ 6.00 min;2:95.0℃ 30 s;3:60.0℃ 30 s;4:72.0℃50 s;Plate Read;5:GOTO 2，65 more times;6:Melt Curve 65℃to 95℃:Increment 0.5℃ for 0.15 min;Plate Read。

1.2.3 计算 PCR软件2-△△Ct方法进行统计分析，重复3次。①对所有的测试样和校准样本，用内参基因的CT值归一目的基因的 CT值:△CT(test) = CT(target，test) － CT(ref，test);△CT(calibrator)=CT(target，calibrator) － CT(ref，calibrator)。② 用校准样本的△CT值归一试验样本的△CT值:△△CT=△CT(test)－△CT(calibrator)。③计算表达水平比率:2-△△Ct=表达量的比值。

得到的结果是通过参照基因表达水平标准的试验样本中目标基因相对于校准样本的增加或减少的倍数，用参照基因校准目标基因表达的目的是弥补样本组织量的差异。

表1 RT-PCR引物序列

1.3 统计学分析 以Quantity one分析软件对实验结果进行分析，试验重复3次，计量数据以表示，采用SPSS13.0软件。组间比较采用方差分析(Dunnett-t检验)。

2 结果

cancer组、Di组、Zhong组、Gao组中细胞 PAR-2 mRNA的相对表达量(15.94±0.25，5.70±2.03，5.36±0.17，6.85±2.00)均高于 normal组(1.00)，有显著性差异(P＜0.001)。cancer组 ＞(Di组、Zhong组、Gao组)＞normal组;但是 Gao组、Zhong组、Di组三组间的相对表达量无显著性差异(P＞0.05)。见图1。

图1 各组PAR2 mRNA水平

3 讨论

PARs家族含有7个跨膜单位，与G蛋白相耦联，可通过介导细胞外信号调节激酶信号转道通路引起细胞核反应，激活多种细胞转录因子〔4〕。PARs主要有四个亚型-PAR-1、PAR-2、PAR-3和PAR-4，其中PAR-1、PAR-3和PAR-4是凝血酶受体，而PAR-2是胰蛋白酶的细胞表面受体〔5，6〕。由于PARs独特的激活与灭活方式以及在消化系统中的广泛分布，使其在消化系统中有非常重要的作用〔7〕，而PAR-2与消化系肿瘤的关系更是备受关注〔8〕。人PAR-2基因位于5q13染色体，小鼠PAR-2基因位于13D2，均为双外显子，是胰岛素、肥大细胞纤维蛋白溶酶、凝血因子Ⅶa、Ⅹa和其他未知蛋白水解酶的受体〔9〕。在蛋白水平，人PAR-2是开放阅读框编码397个氨基酸的跨膜蛋白，与小鼠PAR-2的同源性为83%，与大鼠PAR-2的同源性为85%;在分子水平，PAR-2含有7个跨膜螺旋，氨基端位于细胞外，羧基端位于细胞内，C-末端与受体脱敏和信号转导有关，N-末端有相应受体的蛋白酶裂解位点，易暴露于能使其激活的蛋白酶中，是许多消化系腺体外分泌的直接调控者〔10〕。

文献报道PAR-2激动剂不但可以促进意识清醒的大鼠胰腺分泌〔11〕，也可促使离体大鼠胰腺及淀粉酶的分泌〔12〕;PAR-2在促进小鼠胰腺分泌淀粉酶的同时，也促进NO的产生〔13〕;在狗胰管的实验中，PAR-2激动剂可迅速开放并迅速关闭离子通道〔14〕，而且可能与PAR-2在体内诱导的胰液瞬间分泌升高有关，但是PAR-2在胰腺癌细胞中的表达及其复杂机制目前仍不十分清楚。本研究中，笔者以Quantity one分析软件对实验结果进行分析，试验重复3次，结果cancer组、Di组、Zhong组、Gao组中细胞PAR-2 mRNA的相对表达量均高于normal组。提示胰腺癌的发生、发展与PAR-2正相关。

吉西他滨是一种破坏细胞复制的二氟核苷类抗代谢物抗癌药〔15〕，也是目前治疗胰腺癌的最佳药物。吉西他滨是去氧胞苷的水溶性类似物，对核糖核苷酸还原酶是一种抑制性的酶作用物的替代物，这种酶在DNA合成和修复过程中对所需要的脱氧核苷酸的生成是至关重要的〔14〕。本研究中，笔者将细胞分为cancer组(胰腺癌细胞阳性对照组)、Gao组(高剂量干预，吉西他滨给药浓度50 μg/ml)、Zhong组(中剂量干预，吉西他滨给药浓度5 μg/ml)、Di组(低剂量干预，吉西他滨给药浓度0.5 μg/ml)及normal组(正常胰腺组织阴性对照组);并通过RT-PCR实验观察各组PAR-2 mRNA的相对表达量。结果cancer组＞Di组、Zhong组、Gao组＞normal组。提示相对于正常胰腺组织，PAR-2 mRNA在PANC-1胰腺癌细胞高表达，吉西他滨能够降低PANC-1胰腺癌PAR-2 mRNA的表达率，可能是吉西他滨治疗胰腺癌的作用机制之一。但是把3次PAR-2 mRNA基因表达量进行统计后，Gao组、Zhong组、Di组三组间的相对表达量差异无显著性，即本实验未发现吉西他滨对PAR-2 mRNA表达的干预作用与剂量有关，笔者认为还需要更多的研究以进一步探讨。

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