大鼠组织工程人工骨的体外动态灌注培养构建

张 波 权 毅 谢庆云 潘显明 伍红桦 赵凯敏 屈 波 廖冬发 邓 斌

(解放军成都军区总医院骨科，四川 成都 610083)

创伤及多种原因造成的骨缺损病变日益增多，影响患者活动和劳动能力。随着近年构建工程化组织研究的不断深入，人们发现适当的力学刺激因素可以克服传统骨细胞培养条件的不足，满足细胞在可吸收细胞外基质(ECM)中营养的需要，减少处于中心部位的细胞由于营养不良或代谢不畅而导致的生长迟滞甚至死亡〔1，2〕。因此，研究力学刺激对体外三维立体培养细胞的作用有重要意义。本文探讨采用动态灌注培养方法应用骨髓间充质干细胞(MSC)在纳米复合羟基磷灰石接枝聚乳酸(HA/PLA)材料构建SD大鼠骨组织的效果与应用价值。

1 材料与方法

1.1 支架材料 生物活性可降解HA/PLA纳米复合多孔材料由四川大学提供，该复合材料在PLA上接枝HA和具有促进细胞黏附的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)序列，其孔隙率为93% ～95%，孔径为400～650 μm，压缩强度为120 mPa，压缩模量0.8 Gpa。制成直径为20 mm，厚度5 mm圆片，环氧乙烷熏蒸消毒后备用。

1.2 原代培养 取10月龄SD大鼠(由四川大学实验动物中心提供)适应性饲养2 w，参照文献方法取股骨骨髓〔3，4〕，用低糖DMEM培养基(含10%胎牛血清)原代分离培养MSC，传至第3代，分别按照2×104和2×105ml－1密度接种于多孔支架上。

1.3 灌注实验 灌流培养系统由样品池、蠕动泵、硅胶管道以及培养液瓶组成。分别在0.3，0.6和0.9 ml/min灌注速度实验。并于灌流培养7 d取出细胞/支架复合物，通过MTT法检测细胞生长增殖情况。

1.4 碱性磷酸酶(ALP)活性检测 培养15 d后取细胞支架复合物，切碎，反复冻融法裂解细胞，取裂解液30 μl与0.5 ml缓冲液及0.5 ml基质液充分混匀，37℃水浴15 min，按照试剂盒说明书加入1.5 ml显色剂，混匀，在520 nm处测各管吸光度。1.5 形态学观察 于灌注培养第15天取出细胞支架复合物，PBS清洗，从中间切开，加荧光素二乙醋，37℃孵育5 min后，PBS洗涤，显微镜观察细胞形态。另一部分细胞/支架复合物，经固定、梯度脱水、石蜡包埋后，切片(厚度6 μm)，行HE染色，显微镜下观察。

2 结果

2.1 灌注培养对细胞增殖的影响 MTT检测结果显示，与静止培养相比较，灌注培养7 d细胞在支架中的活力显著增加，且细胞活力随着接种细胞密度的增大而增加，表明灌注培养可以促进细胞增殖。在相同细胞密度条件下，中速(0.6 ml/min)与快速灌注(0.9 ml/min)较慢速(0.3 ml/min)显著促进细胞生长;中速与快速灌注对细胞增殖影响差别不显著。通过正交法表明最佳培养条件为:细胞密度2×105ml-1，灌注流速为0.6或0.9 ml/min。

表1 MTT法测定不同接种密度MSC在不同灌注速度增殖情况(，n=3)

表1 MTT法测定不同接种密度MSC在不同灌注速度增殖情况(，n=3)

与0.3 ml/min比较:1)P＜0.05;与对照组比较:2)P＜0.05

组别 2×104ml－1 0 0.3 ml/min 0.6 ml/min 0.9 ml/min 2×105ml-1 0 0.3 ml/min 0.6 ml/min 0.9 ml/min实验组 － 0.47±0.052) 0.57±0.041)2) 0.59±0.051)2) － 0.83±0.05 0.95±0.061)2) 0.98±0.051)2)对照－组0.39±0.04 － － － 0.71±0.06 － －

2.2 ALP活性检测 分别于体外培养15 d取样，切碎，经组织匀浆，使用ALP测定试剂盒进行ALP活性检测。在接种细胞密度为2×105ml-1时，与静止培养(0.007±0.001)比较，灌注培养(灌注速度为0.6 ml/min)骨组织ALP活性(0.063±0.001)明显增高，证明实验组更能促进MSC向成骨细胞分化。

2.3 灌注培养对骨组织形态的作用 荧光和HE染色可见成骨细胞在支架中均匀分布，证明通过MSC诱导分化成骨细胞能够在HA/PLA三维多孔支架上生长。与对照组相比，实验组细胞数量和密度更大，因而可以推断出灌流培养产生的剪切力更适合人工骨组织构建，用灌注生物反应器系统来进行MSC的三维立体扩增和分化是可行的，可以用于骨组织工程研究。

3 讨论

组织工程为修复骨缺损提供了一个新的思路和方法。种子细胞在复合支架材料上通过体外扩增、共培养，形成与骨组织结构与功能相似的新生组织来修复骨缺损。MSC是一种理想的组织工程种子细胞。体外培养的MSC具有强大的增殖能力，而且具有多向分化潜能。支架中生长的细胞首先要能够分布均匀，以获得均匀的新生组织。多孔支架应具有促进细胞黏附、增殖和分化的功能，以提高新生组织的生成速度。PLA及其共聚物具有良好的生物降解性和组织相容性，在软骨和骨组织工程应用中显示出较好的性能而被广泛应用。本文采用的生物活性多孔 HA/PLA，在合成高分子 PLA上接枝 HA和RGD，既有骨修复成分HA，又有增强细胞黏附的短肽序列。结果显示，生物活性HA/PLA支架能够促进MSC黏附和迁移。将MSC以一定的密度接种到HA/PLA支架中后进行灌流培养，细胞保持了较高的活力和增殖活性，基质分泌旺盛。由此证明，对于MSC的三维立体培养和扩增是高效、可行的。

灌注式培养利用细胞营养液流经支架材料的孔隙给细胞提供足够的物质输送，同时提供一定的机械剪应力刺激作用，适合大块组织的体外构建。对比于静态培养，灌注反应体系可促进细胞的活力和功能，增强成骨分化而且使细胞在支架内的分布更均匀。

1 宋 飞，梅冠宇，宋克东，等.成骨细胞不同体外培养方式的耗氧速率检测〔J〕.中国组织工程研究与临床康复，2008;12(24):4606-9.

2 闫香珍，杨丕山.骨组织工程技术瓶颈及其原因分析〔J〕.国际口腔医学杂志2009;36(1):117-9.

3 田 甜，章庆国.力学刺激促进软骨细胞与骨髓基质干细胞共培养体外软骨分化〔J〕.中国美容医学，2009;18(5):658-62.

4 陈 鹏，刘 冰，毛天球.纳米羟基磷灰石/胶原/聚乳酸材料复合自体骨髓基质细胞修复犬下颌骨节段性缺损的实验研究〔J〕.北京口腔医学，2009;17(4):195-8.