醛固酮对人肾小管上皮细胞表达纤溶酶原激活物抑制物-1和纤维连接蛋白的影响

孙东立 李晓东 (唐山市工人医院肾内科，河北 唐山 063000)

肾间质纤维化是各种原因所致慢性肾脏疾病进展至终末期肾衰竭的共同途径〔1〕。肾间质纤维化的本质就是细胞外基质(extracellular matrix，ECM)的异常沉积，而ECM过度合成和降解受抑制是ECM积聚的直接原因〔2〕。最近研究表明，醛固酮(aldosterone，ALD)在肾间质纤维化的发病机制中起着重要作用〔3〕，可促进体外培养的肾小管上皮细胞表达致纤维化的细胞因子，如转化生长因子(TGF)-β1、结缔组织生长因子(CTGF)等〔4，5〕。但ALD是否通过调节ECM的合成和降解导致肾间质纤维化的进展，目前尚未见报道。本研究通过观察ALD对人肾小管上皮细胞表达纤溶酶原激活物抑制物-1(plasminogen activator inhibitor-1，PAI-1)和纤维连接蛋白(fibronectin，FN)的影响，以探讨ALD在肾间质纤维化发病机制中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料 人近端肾小管上皮细胞HK-2细胞购自中国协和医科大学细胞中心(来源于美国ATCC)。D-ALD(美国Sigma)，Trizol试剂(美国 Invitrogen)，逆转录试剂盒(美国 Promega)，FN ELISA试剂盒(武汉博士德)，胎牛血清(FBS)、DMEM/F12培养基(美国Gibco)。

1.2 细胞培养及药物干预 HK-2细胞培养于含5%FBS的DMEM/F12培养液中，实验前用无血清培养液同步化24 h。参照文献〔6〕及预试验结果，分别加入终浓度为 0、10－11、10－10、10－9、10－8mol/L ALD 含 5%FBS 的 DMEM/F12 培养液刺激HK-2细胞48 h。

1.3 半定量RT-PCR法检测细胞中PAI-1和FN mRNA的表达 Trizol提取细胞总RNA，琼脂糖电泳鉴定RNA完整性，测定A260/A280均＞1.8。取2 μg RNA反转录为 cDNA。应用Primer Premier 5软件设计引物，PAI-1(431 bp):正义5'-GTA TCT CAG GAA GTC CAG CC-3'，反义 5'-TCT AAG GTA GTT GAA TCC GAG C-3';FN(639 bp):正义5'-CGAAATCACAGCCAGTAG-3'，反义 5'-ATC ACA TCC ACA CGG TAG-3';β-actin(202 bp):正义5'-CCT TCC TGG GCA TGG AGT CCT G-3'，反义5'-GGA GCA ATG ATC TTG ATC TTC-3'。引物由上海生工合成。PCR反应条件为:94℃变性5 min;然后94℃ 30 s，58℃30 s，72℃ 45 s，共30个循环;再于72℃延伸7 min。PCR 产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统中扫描成像、分析电泳条带灰度值。计算目的基因与内参β-actin灰度值的比值，即得目的基因mRNA的相对表达量。

1.4 ELISA法检测细胞培养上清液中FN的含量 收集细胞上清液，ELISA法检测细胞上清液中FN的含量，按试剂盒说明书操作。

1.5 统计学分析 应用SAS8.1统计软件，计量资料用表示，组间比较采用单因素方差分析，两均数比较采用q检验。

2 结果

2.1 ALD对HK-2细胞中PAI-1和FN mRNA表达的影响 半定量RT-PCR结果显示，正常HK-2细胞中有少量PAI-1和FN基因表达，不同浓度的ALD刺激HK-2细胞48 h后，其表达量与对照组比较均明显增加，且呈一定的剂量依赖性(P＜0.05)。见图1。

图1 ALD对HK-2细胞中PAI-1和FN mRNA表达的影响

2.2 ALD对HK-2细胞培养上清液中FN含量的影响 正常HK-2细胞培养上清液中有一定含量的 FN〔(96.7±10.5)ng/ml〕，10－11、10－10、10－9、10－8mol/L 浓度的 ALD 刺激细胞48 h后，培养上清液中FN的含量分别为(126.0±12.3)、(135.3±17.6)、(148.4 ±14.4)、(161.2 ±15.1)ng/ml，均明显增加，且具有一定的剂量依赖性(P＜0.05)。

3 讨论

在肾间质纤维化的过程中，ECM并不是静止不动的，而是处在不断代谢更新、降解重塑的动态平衡中〔7〕。ECM合成增加和降解减少是ECM过度积聚的直接原因。PAI-1是纤溶酶原激活物最重要的抑制剂，许多肾脏疾病(如肾小球肾炎、新月体性肾炎、IgA肾病、狼疮性肾炎等)肾组织局部PAI-1表达上调，PAI-1的变化在肾间质纤维化的发生和发展中起着重要作用〔8〕。TGF-β1、CTGF、肿瘤坏死因子-α、表皮生长因子等对PAI-1均具有上调作用〔9～11〕。本实验结果显示，ALD呈剂量依赖性地促进HK-2细胞PAI-1的基因表达。PAI-1的表达增加将抑制纤溶酶原激活物t-PA和u-PA的生物学功能，使纤溶酶原转变为纤溶酶减少，引起ECM降解障碍，导致ECM合成和降解失衡，ECM过度积聚，从而在肾间质纤维化的过程中发挥作用。

肾间质纤维化过程中，沉积在肾间质的ECM成分主要有FN和胶原等。FN是这一过程中首先出现的ECM，起支架作用，对介导细胞迁移、黏附及其他ECM成分的沉积起重要作用，其变化显示了ECM质和量的改变〔12〕。本实验从基因和蛋白质两个水平研究ALD对HK-2细胞表达FN的影响，结果显示，ALD呈剂量依赖性地促进HK-2细胞合成和分泌FN，从而促进肾间质ECM积聚，导致肾间质纤维化的发生、发展。

因此，ALD可能通过促进HK-2细胞ECM的合成，并上调PAI-1的表达，抑制ECM降解，两种机制共同作用促进肾间质纤维化的进展。拮抗ALD对HK-2细胞的作用可能成为防治肾间质纤维化的新途径。

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