Cox-2启动子在人脑胶质瘤细胞中的特异性启动

白利民 申 强 (吉林省人民医院，吉林 长春 130021)

条件复制型腺病毒又称肿瘤特异性增殖型腺病毒，目前最广泛地应用于肿瘤的基因治疗。肿瘤与正常细胞组织因基因结构上的差异，出现了包括代谢、增生、生长等多方面的明显差异。肿瘤细胞复制过程中可以大量分泌出正常细胞无法分泌或者少分泌的物质，条件复制型腺病毒可以利用这些物质对病毒产生特异的靶向性，可在肿瘤细胞内复制增生，达到目的基因蛋白表达，最终杀死肿瘤细胞。鉴于良好的启动活性和肿瘤特异性，Cox-2等启动子越来越成为基因治疗中研究的热点与重点〔1～7〕，并已构建Cox-2启动子携带E1A的条件复制性腺病毒 (Ad-Cox-2-E1A)〔8〕。本文通过荧光素酶报告基因原理，检测Cox-2启动子在实验细胞中的启动活性。

1 材料与方法

1.1 材料 荧光素酶检测试剂，RNeasy Mini kit，RNase inhibitor，Adeno-XTM Expression System，MTT 试剂盒，病毒基因组提取试剂盒，RNA提取试剂盒，DMEM medium，HEK293细胞组，anti-Cox-2抗体，anti-E1A抗体，Western印迹试剂等。

1.2 方法

1.2.1 重组条件复制性腺病毒的获得

1.2.1.1 重组腺病毒质粒的构建及鉴定 本实验所用的腺病毒载体为人血清5型腺病毒，重组腺病毒质粒Ad-Cox-2-E1A经酶切和测序鉴定。PCR Cox-2 promoter的模板为Hela细胞基因组，引物为:同义引物:5'-TAACTATAACGGTCCTAAGGTAGCGAAGGTACCTGGTGTAGTTTTA-3'，反义引物:5'-GAATTCGCTAGCCGCTGCTGAGGAGTTCC-3'。PCR E1的模板为HEK293细胞基因组，引物为:E1-1同义引物:5'-CCGGAATTCATGAGACATATTATCTGCCAC-3'，E1-1，反义引物:5'-GTATTCCTCCGGTGATAAT-3';E1-2同义引物:5'-ATTATCACCGGAGGAATAC-3'，反义引物:5'-CAGAAAATCCAGCAGGTAC-3';E1-3同义引物:5'-GTACCTGCTGGATTTTCTG-3'，反义引物:5'-ACCCATAGAAGCTTACACC-3';E1-4同义引物:5'-GGTGTAAGCTTCTATGGGT-3'，反义引物:5'-CCGGAATTCGTCGACGCTGCTGCAAAACAG ATA C-3'。

1.2.1.2 重组腺病毒的鉴定 PCR法鉴定:用病毒基因组提取试剂盒提取病毒基因组，PCR腺病毒基因组E2b特异性片段鉴定腺病毒。同义引物:5'-tcgtttctcagcagctgttg-3'，反义引物:5'-catctgaactcaaagcgtgg-3'。PCR E1基因鉴定外源基因，同义引物:5'-ATTATCACCGGAGGAATAC-3'，反义引物:5'-CAGAAAATCCAGCAGGTAC-3'。

Western印迹鉴定E1蛋白表达:SDS-PAGE电泳分离，转膜，洗膜，显色，漂洗。(具体操作参照《分子克隆实验指南》)。采用的抗腺病毒E1A一抗为本实验室自制多克隆兔血清。

1.2.2 荧光素酶表达的检测 在6孔板中，将Ade-Cox-2-luciferase 或 Ade-CMV-luciferase 3 μg 用 lipo2000 8 μl转染实验细胞，设Ad-Blank(非复制性5型腺病毒)为阴性对照，CMV(巨细胞病毒)为阳性对照，用裂解缓冲液在板中裂解细胞，晃动培养皿数次以保证裂解缓冲液完全覆盖细胞。将细胞从培养皿刮下，将细胞及所有的液体转移至离心管中，置于冰上，旋涡震荡离心管5～10 s，12 000 r/min离心15 s(室温)。将上清液转移至一个新的试管中。将100 μl荧光素酶检测试剂加入荧光光度计试管中，每管一个样品。将荧光光度计的程序设置为:2 s延迟及10 s荧光素酶活性测量读数。将20 μl细胞裂解液加入装有荧光素酶检测试剂的荧光光度计试管中，吹打或轻微旋涡震荡以混合，上机检测并记录读数。

2 结果

2.1 重组腺病毒质粒的构建 按照腺病毒质粒构建流程图构建重组腺病毒质粒Ad-Cox-2-E1，I-Ceu I/PI-SceI双酶切质粒Ad-Cox-2-E1，电泳约4 500 bp及32 000 bp处有点，得阳性克隆。见图1。

2.2 按照腺病毒质粒构建流程图构建重组腺病毒质粒 ICeu I/PI-SceI双酶切质粒Ad-Cox-2-luciferase，电泳约4 000 bp及32 000 bp处有点，得阳性克隆。I-Ceu I/PI-SceI双酶切质粒Ad-CMV-luciferase，电泳约3 300 bp及32 000 bp处有点，得阳性克隆。见图2。

2.3 重组腺病毒的鉴定 Ad-Cox2-E1在基因水平有特异性E1基因，大小约为3 000 bp，特异性E2b基因，大小为860 bp;在蛋白水平，Ad-Cox2-E1感染细胞均有特异性E1A蛋白表达，大小约为45 kD。说明在包装扩增纯化过程中，重组腺病毒片段没有丢失，外源基因表达正常。见图3。

2.4 Ad-CMV-luciferase或Ad-Cox-2-luciferase感染实验细胞，检测luciferase表达 见图4。

图1 质粒Ad-Cox-2-E1的鉴定

图2 质粒Ad-Cox-2-luciferase和Ad-CMV-luciferase的构建

图3 腺病毒Ad-Cox-2-E1的检测

图4 Luciferase的活性检测

近年来研究表明Cox-2在脑胶质瘤、卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、胃癌等多种肿瘤中表达上调，参与肿瘤的发生发展和转移〔1～4〕，并参与肿瘤新生血管的形成，而在大多数正常组织中不表达〔5〕。作为一种新的肿瘤特异性启动子，人们对COX-2启动子进行了广泛的研究，并且其在脑胶质瘤、胃肠癌、食道癌〔6，7〕的基因治疗研究中表现出很好的治疗前景。

条件复制型腺病毒(conditionally replicating adenovirus，CRAd)是针对腺病毒本身无明显特异性复制表达的缺点而构建出来的病毒，它具有的特异性复制能力及腺病毒本身固有的生物特性，放大了肿瘤治疗作用和溶瘤作用〔9〕。现今，条件复制型腺病毒越来越受到人们的重视，并对其开展了广泛深入的研究。条件复制型腺病毒与传统的复制缺陷腺病毒比较有以下优点:①病毒可以在肿瘤细胞内大量增殖，直接导致被感染的肿瘤细胞裂解，裂解扩散的病毒可以继续感染邻近肿瘤细胞;②腺病毒基因表达的过程中释放大量的肿瘤抗原蛋白，传递给树突细胞和T细胞识别，起到了免疫放大效果，加强了肿瘤免疫反应;③条件复制型腺病毒自身体积变小，可容量明显变大，所以可携带较大片段的外源性治疗基因，即它在肿瘤细胞内复制的同时还通过携带治疗基因达到杀灭肿瘤的效果，这也打下了多途径多方法联合应用的基础。从理论上讲，在肿瘤基因治疗中，条件复制性腺病毒及携带的抗癌活性基因只要肿瘤细胞存在，抗癌活性基因就会继续表达，直至杀死全部的肿瘤细胞为止。这与因药物半衰期而疗效减退的常规治疗大不相同，所以条件复制性腺病毒在肿瘤治疗中表现出了良好的治疗持续性。

荧光素酶报告基因〔10〕是把荧光素酶基因的编码序列和基因表达调节序列融合形成嵌合基因，或与其他目的基因融合，在调控序列控制下进行表达，通过荧光素酶生物发光特性，利用闪烁计数器对荧光素酶的活性作出定量定性检测来标定目的基因的表达状况。荧光素酶有以下优点:灵敏度高，特异性好，应用范围广，无毒性。基于上述优点，本研究将荧光素酶基因插入Cox-2启动子之后，监测Ad-Cox-2与Ad-CMV在正常细胞与脑胶质瘤细胞中表达量。Ad-Cox-2-luciferase感染正常细胞，luciferase表达的值为894±100.5，是空白组表达的1.8倍，说明Cox-2启动子在正常细胞中基本没有检测到启动活性;Ad-Cox-2-luciferase感染脑胶质瘤细胞，luciferase表达的值为10 483±765.6和12 387±1004.2，是相应空白组的27倍和30倍，说明在脑胶质瘤细胞中Cox-2启动子具有高启动活性，但是Cox-2启动子在肿瘤细胞中的启动活性稍低于CMV启动子。以上结果可以说明，在腺病毒载体中Cox-2启动子在正常脑成纤维细胞中不具有启动活性，即启动特异，其所携带的基因只在肿瘤细胞中特异性表达，从而达到比较好的治疗作用，同时降低对于周围细胞的副作用。

本实验成功构建并鉴定COX-2启动子携带E1A的条件复制性腺病毒(Ad-COX-2-E1A)，并通过荧光素酶报告基因证实了Ad-COX-2-E1A在胶质瘤细胞中的启动特异性，可以利用其驱动治疗基因特异性表达，实现肿瘤的基因治疗。

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4 Shigemasa K，Tian X，Gu L，et al.Expression of cyclooxygenase-2 and its relationship to p53 accumulation in ovarian adenocarcinomas〔J〕.Int J Oncol，2003;22(1):99-105.

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6 Yamamoto M，Alemany R，Adachi Y，et al.Characterization of the cyclooxygenase-2 promoter in an adenoviral vector and its application for the mitigation of toxicity in suicide gene therapy of gastrointestinal cancers〔J〕.Mol Ther，2001;3(3):385-94.

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8 申 强，于 音.COX-2启动子携带E1A的条件复制性腺病毒(Ad-COX-2-E1A)的构建及鉴定〔J〕.中国老年学杂志，2010;24(30):3736-9.

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10 杜彦艳，单保恩.报告基因荧光素酶在科研中的应用〔J〕.中华肿瘤防治杂志，2009;16(9):715-8.