叶酸对高同型半胱氨酸血症大鼠学习记忆能力的影响

张海红，曹家松，刘 欢，王永明，黄国伟

（天津医科大学公共卫生学院营养与食品卫生学教研室，天津300070）

同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）是蛋氨酸代谢的重要中间产物，高同型半胱氨酸血症（hyperhomocysteine，HHcy）被确立为心脑血管疾病和神经系统疾病的一个重要独立危险因子，在疾病的发生发展过程中具有直接的作用[1]。叶酸是Hcy循环过程中重要的辅助因子，叶酸水平的升高可促进Hcy的再甲基化代谢，从而降低血浆中Hcy水平。叶酸缺乏与大脑的学习记忆功能减退存在关联[2]，是认知功能障碍的又一危险因素。近年来，叶酸对神经系统的保护作用已成为研究热点，但叶酸的具体作用机制尚不完全清楚。本研究通过高蛋氨酸饮食制备大鼠HHcy模型，并予以叶酸干预，探讨Hcy对大鼠学习记忆能力的影响及叶酸干预的效果，观察叶酸是否能够通过降低Hcy水平提高大鼠的学习记忆能力。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 雄性Sprague-Dawley大鼠，24只，体重250～280 g。购自天津市山川红实验动物科技有限公司[许可证号 scxk（津）2009-0001]。

1.1.2 试剂 L-蛋氨酸（分析纯）、叶酸（美国Sigma公司进口分装）购自天津市联星生物技术有限公司。大鼠Hcy ELISA试剂盒（美国RD进口分装）购自厦门慧嘉生物科技有限公司。

1.1.3 仪器 Morris水迷宫为中国医学科学院药物研究所产品。

1.2 研究方法 实验前，将大鼠自由饲养2周，以适应实验室环境。将大鼠随机分为3组，每组8只，分别为正常组、蛋氨酸组、蛋氨酸+叶酸组。正常组给予普通饲料喂养，蛋氨酸组、蛋氨酸+叶酸组给予添加3%蛋氨酸饲料喂养，同时正常组和蛋氨酸组每天给予0.8 mg/（kg·bw）生理盐水灌胃，蛋氨酸+叶酸组每天给予0.8 mg/（kg·bw）叶酸灌胃。分别于实验前（第0周）、干预后4周、8周、12周、16周内眦静脉取血测定血浆Hcy浓度。并于16周后采用Morris水迷宫对大鼠进行行为学检测。

1.2.1 血浆Hcy测定 大鼠内眦静脉血1 mL，10%肝素钠抗凝，3000 r/min离心10 min，取上清液（血浆），使用大鼠Hcy ELISA试剂盒进行检测，具体操作步骤严格遵照说明书要求进行。

1.2.2 Morris水迷宫检测大鼠学习记忆能力 Morris水迷宫为直径150 cm、高50 cm圆形水池，水池内壁为黑色，池内水深25 cm，实验时用墨水将水染成黑色，以利于捕捉大鼠运动轨迹，水温保持在（25±1）℃，房间内光照恒定，池壁上以4个等距离点将水池分为4个象限，在第一象限内距离池壁32.5 cm处放有直径为10 cm、高24 cm的圆形黑色平台，平台位于水面下1 cm。池壁4个象限分别贴有不同的标记物。池壁向中心15 cm处画圆，再向中心15 cm画圆，外环为20%边缘区域，中环为40%边缘区域，内环为中心区域（具体区域划分见图1）。迷宫上方安置连接显示系统的摄像机，同步记录大鼠运动轨迹。

图1 水迷宫区域划分图Fig 1 Water maze zoning map

1.2.2.1 定位航行实验：实验前1 d，让大鼠熟悉水迷宫环境，平台在第1象限内。第2天开始正式实验，实验历时5 d，每天分别于上午和下午各进行4次训练，分别从Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ象限池壁中心位置的4个点入水，将大鼠面部背向站台沿池壁放入水中，记录其搜寻平台的时间即逃避潜伏期。如大鼠在120 s内未找到平台，则将其引向平台，并使其在平台上停留30 s，此时其潜伏期记为120 s，测试过程中保持实验室内光照、物品等外界条件及空间参照物摆放位置不变，以排除外界条件干扰。

1.2.2.2 空间探索实验：实验第6天，撤走平台，任选一个入水点，将大鼠面向池壁放入水中，记录大鼠在120 s内的游泳轨迹，第一次穿越平台的时间，120 s内穿越平台的次数及在20%边缘区域、40%边缘区域、中心区域停留的时间百分比，并根据大鼠在水中搜索站台的游泳轨迹确定其每次的搜索策略，以此判断大鼠的记忆能力。搜索方式分为趋向式、随机式、边缘式3种方式，根据大鼠入水后寻找目标区域的游泳轨迹来确定。

1.3 统计学处理 用SPSS 16.0统计软件，大鼠血浆Hcy浓度、Morris水迷宫的逃避潜伏期时间采用重复测量方差分析，其它采用单因素方差分析，数据以±s表示，检验水准 α=0.05。

2 结果

2.1 血浆Hcy浓度 重复测量方差分析表明，实验数据具有显著的时间和组间效应，按不同时间点分析，随着给药周数的增加，蛋氨酸组大鼠血浆Hcy浓度呈上升趋势（P<0.05）。按照不同处理组分析，与正常组比校，蛋氨酸组大鼠血浆Hcy浓度值在第8周、第12周和第16周均高于正常组，差别具有统计学意义（P<0.05），与蛋氨酸组比较，蛋氨酸+叶酸组有所下降（P<0.05），具体结果见表1。

表1 各组大鼠血浆Hcy浓度比较（n=8,±s，μmol/L）Tab 1 The comparison of plasma Hcy concentrations of rats in each group（n=8,±s，μmol/L）

表1 各组大鼠血浆Hcy浓度比较（n=8,±s，μmol/L）Tab 1 The comparison of plasma Hcy concentrations of rats in each group（n=8,±s，μmol/L）

与正常组比较*P<0.05；与蛋氨酸组比较#P<0.05；与第0周比较△P<0.05；与第 8 周比较★P<0.05

组别正常组蛋氨酸组蛋氨酸+叶酸组第4周9.09±0.809.82±1.208.51±1.11第0周9.06±1.419.10±1.658.28±1.70第8周8.89±1.1411.40±0.48*8.62±0.86#第12周9.25±0.7615.10±0.37*△★8.83±0.81#第16周9.18±0.7817.54±0.11*△★9.08±0.41#

2.2 Morris水迷宫定位航行实验潜伏期结果 重复测量方差分析表明，Morris水迷宫定位航行实验的数据具有显著的时间和组间效应，提示在测试期间，各组大鼠寻找平台的潜伏期时间随着训练天数增加呈显著性下降趋势（P＜0.05），通过组间比较，在定位航行第1天、第5天，大鼠各组间逃避潜伏期未见明显差异；定位航行第2天、第3天和第4天，蛋氨酸组潜伏期长于正常组（P<0.05），蛋氨酸+叶酸组较蛋氨酸组缩短（P<0.05），从整个定位航行实验结果看，各组大鼠虽然在第5天的潜伏期无明显差异，但第2天、3天、4天的学习过程中出现显著性差异，正常组和蛋氨酸+叶酸组的潜伏期缩短较快且比较稳定，蛋氨酸组则较弱，说明蛋氨酸组大鼠获得记忆能力的时间要长于正常组，蛋氨酸+叶酸组大鼠获得记忆能力的时间短于蛋氨酸组。具体结果见表2。

表2 各组大鼠定位航行实验平均逃避潜伏期时间（n=8,±s，s）Tab 2 The mean escape latency in place navigation test of rats in each group（n=8,±s，s）

表2 各组大鼠定位航行实验平均逃避潜伏期时间（n=8,±s，s）Tab 2 The mean escape latency in place navigation test of rats in each group（n=8,±s，s）

与正常组比较*P<0.05；与蛋氨酸组比较#P<0.05；与第1天比较△P<0.05；与第2天比较★P<0.05

组别正常组蛋氨酸组蛋氨酸+叶酸组第2天77.71±16.86△92.94±15.52*△65.90±16.47#△第3天43.24±9.59△★67.76±16.43*△★41.72±7.44#△★第4天31.60±11.25△★45.74±13.31*△★27.66±7.75#△★第5天14.33±5.85△★17.00±6.17△★14.67±8.31△★第1天93.51±16.23★107.10±10.19★98.22±13.77★

2.3 Morris水迷宫空间探索实验结果 与正常组相比，蛋氨酸组大鼠在第Ⅰ象限内停留时间、穿越平台次数、40%边缘区域停留时间减少，第一次穿越目标区时间、20%边缘区域停留时间、路径长度增长（P<0.05）；与蛋氨酸组相比，蛋氨酸+叶酸组在第Ⅰ象限内停留时间、穿越平台次数、40%边缘区域停留时间增多，第一次穿越目标区时间、20%边缘区域停留时间、路径长度减少（P<0.05）。从120 s内的游泳轨迹图（图2）中可以看出，各组大鼠寻找平台的搜索策略和游泳路径也有所不同，正常组、蛋氨酸+叶酸组大鼠通过趋向式的搜索方式向着平台所在区域寻找平台，游泳路径相一致，蛋氨酸组则通过随机式的搜索方式在各象限寻找平台，游泳路径表现出明显差异，综合整个空间探索实验，蛋氨酸组大鼠记忆保持能力降低，蛋氨酸+叶酸组大鼠记忆保持能力得到改善。具体结果见表3、4。

表3 各组大鼠空间探索实验结果Tab 3 The results of spatial probe test of rats in each group

表4 各组大鼠在不同区域停留的时间百分比（%）Tab 4 The percentage of time spent on different region of rats in each group（%）

图2 各组大鼠空间探索实验轨迹图Fig 2 The tracing image of spatial probe test of rats in each group

3 讨论

叶酸是Hcy代谢过程中重要的甲基供体，叶酸缺乏时，就会产生HHcy血症，有研究发现，高浓度的叶酸摄入可有效的降低阿尔茨海默病（AD）的发病率或延缓病情的发生发展[3-4]。

Alagidisa等[5]通过给成年大鼠注射Hcy，第14周进行水迷宫测试时出现差异。Baydas等[6]通过促黑素可降低血浆Hcy水平，并改善大鼠学习记忆能力。通过给予大鼠高蛋氨酸饲料，成功建立HHcy模型，并予以叶酸灌胃干预，通过Morris水迷宫实验的定位航行实验和空间探索实验中各项指标，多方位、多角度，全面跟踪分析大鼠学习记忆能力的变化情况。Morris水迷宫是实验动物在水中寻找隐藏平台并通过分析其寻找平台所用时间和所走路径判断其记忆功能好坏的实验方案，是一种研究空间学习记忆的标准实验[7]。通过各项结果显示，蛋氨酸组大鼠血浆Hcy水平随着干预时间延长高于正常组（P<0.05），蛋氨酸+叶酸组的血浆Hcy水平低于蛋氨酸组，说明通过叶酸的干预可以促进体内Hcy代谢，降低血浆中Hcy的水平。定位航行实验结果表明体内Hcy的升高对大鼠获取学习记忆能力有一定的影响，通过补充叶酸可以提高大鼠的学习记忆能力。空间探索实验结果证明体内Hcy的升高对大鼠保持记忆能力有损伤作用，补充叶酸可以改善大鼠保持记忆的能力。

本实验通过行为学检测表明，血浆中Hcy含量升高对大鼠的学习记忆能力减退有一定的影响，提示通过早期补充叶酸可以降低血浆中的Hcy浓度，并改善学习记忆能力。关于叶酸改善学习记忆的机制，目前尚处在研究初期阶段，笔者之前的实验发现，补充叶酸能够促进体外培养的大鼠神经干细胞的增殖和分化，并能促进成年动物缺氧损伤的中枢神经系统进行生长、修复[8-10]，但叶酸对认知功能的具体作用机制还有待从分子水平进一步深入探讨。

［1］谢荣，李金贤，牛晓珊，等.血浆同型半胱氨酸与脑血管病相关性研究进展[J].中国康复医学杂志，2008，23（11）：1056

［2］杨慧敏，林茹珠，廖国仪，等.叶酸缺乏与学习记忆及海马突触体膜流动性相关性研究[J].营养学报，2002，24（4）：357

［3］Leblhuber F,Walli J,Artner-Dworzak E,et al.Hyperhomocysteinemia in dementia[J].Neural Transm,2000,107（12）:1469

［4］王鲁宁，王青，汪茜，等.老年性痴呆患者血清叶酸和维生素B12的临床观察[J].卒中与神经疾病,2003,10（4）:230

［5］Algaidi SA,Christie LA,Jenkinson AM,et al.Long-term homocysteine exposure induces alterations in spatial learning,hippocampal signalling and synaptic plasticity[J].Exp Neurol,2006,197（1）:8

［6］Baydas G,Ozer M，Yasar A，et al.Melatonin improves learning and memory performances impaired by hyperhomocysteinemia in rats[J].Brain Res,2005,1046（1/2）:187

［7］Maei HR,Zaslavsky K,Teixeira CM,et al.What is the most sensitive measure of water maze probe test performance[J].Front Integr Neurosci,2009,3:4

［8］Liu H,Huang GW,Zhang XM,et al.Folic acid supplementation stimulatesnotchsignalingandcellproliferationin embryonic neural stem cells[J].J Clin Biochem Nutr,2010,47（2）:174

［9］赵莹，常红，黄国伟，等.叶酸对局灶性脑梗死大鼠神经干细胞增殖作用的影响[J].天津医科大学学报，2009,15(3)：342

［10］Iskandar BJ,Nelson A,Resnick D,et al.Folate supplementation enhances repair of the adult central nervous system[J].Ann Neurol,2004,56（2）:221