马钱子碱及生物转化氮氧化物对斑马鱼胚胎毒性的研究

张启春， 杨雨微， 卞慧敏

(南京中医药大学药学院临床药理教研室，江苏南京210029)

斑马鱼具有产卵多、性周期短、易于饲养等特点，其胚胎体外受精和发育，胚胎透明，便于镜下观察形态变化。近年来，斑马鱼作为一种模式动物越来越多地应用于发育和毒理学研究［1-2］。但就斑马鱼在中药研究中应用的报道尚不多见。

马钱子作为散血热、消肿、止痛的药物，具有显著的镇痛、抗炎、抗肿瘤、兴奋中枢等作用，用于风湿顽痹、麻木瘫痪、痈疽肿痛等症［3-4］。马钱子碱(brucine，B)既是马钱子有效成分，又是毒性成分，其治疗剂量和中毒剂量接近。马钱子碱中毒主要表现为神经毒性。故马钱子多以炮制品入药，炮制过程中马钱子碱可转化为马钱子碱氮氧化物(brucine N-oxide，BN)。炮制后的氮氧化物毒性仅分别为前化合物的1/15，中毒潜伏期显著延长［5］。

本实验以斑马鱼为研究对象，通过斑马鱼胚胎发育过程的观察，评价马钱子碱及生物转化后产物马钱子碱氮氧化物对胚胎发育影响的差异，同时为中药毒理评价尝试一种新的方法。

1 材料

1．1 鱼种的饲养及受精卵收集 将成年野生型A×B品系斑马鱼饲养在经活性碳处理、紫外线消毒并经充分曝气的养鱼用水内。水温保持(28±1)℃，pH 值为(8．0 ±0．3)，溶解氧量 5 ～10 mg/L，总硬度68 mg/L(以 CaCO3计)，总氨量 ＜0．1mg/L。实验室光照-黑暗周期为14 h∶10 h。

雌鱼交配后在鱼卵收集器产生受精卵，2 h后将受精卵用虹吸管取出，用蒸馏水、培养液清洗鱼卵以除去粪便等杂物。收得鱼卵后放入鱼卵孵化液中。受精卵发育6 h，解剖显微镜下挑选出正常的并已达到囊胚期的斑马鱼受精卵放入24孔板进行实验。

1．2 试剂与仪器 马钱子碱，日本和光纯药株式会社;马钱子氮氧化物，南京中医药大学潘扬教授惠赠;吖啶橙，Tricaine，Sigma 公司;Hank’s液:0．137 mol/L 氯化钠，5．4 mol/L 氯化钾，0．25 mmol/L 磷酸氢二钠，0．44 mmol/L 磷酸二氢钾，1．3 mmol/L 氯化钙，1．0 mmol/L硫酸镁，4．2 mmol/L 碳酸氢钠;SZX9解剖显微镜，正置荧光显微镜，OLYMPUS。

2 方法

LC50观察:配制马钱子碱 10 000、5 000、3 000、2 000、1 000、500、200、100 μmol/L 质量浓度，马钱子碱氮氧化物 20 000、10 000、5 000、2 000、1 000、500μmol/L质量浓度。将收集的受精卵浸入上述含不同质量浓度药物的培养液中，进行24、96 h连续培养。

孵化率、存活率及形态学观察:将斑马鱼受精卵浸入含 2 000、1 000、500、200、100 μmol/L 马钱子碱及其氮氧化物的溶液中，观察72 h孵化率;以100 μmol/L质量浓度观察 24、48、72、96 与 120 h 存活率;200 μmol/L 质量浓度下，分别观察 24、36、48、72 h形态变化。

凋亡检测:培养96 h后斑马鱼吖啶橙染色，荧光显微镜观察;另培养24 h受精卵，胰酶消化，吸管吹散混匀，流式细胞仪检测。

3 统计方法

使用SPSS11．5统计软件进行t检验，机率单位加权回归法(Bliss法)法用以计算半数致死浓度(LC50)。

4 结果

4．1 马钱子碱及其碱氮氧化物对斑马鱼胚胎及幼鱼的LC5024 h马钱子碱、马钱子碱氮氧化物LC50分别为 1．81、25．827 mmol/L，96 h 马钱子碱、马钱子碱氮氧化物 LC50分别为 0．364、3．646 mmol/L。结果表明，马钱子碱对斑马鱼胚胎及幼鱼的毒性大于马钱子碱氮氧化物，前者LC50是后者的10～15倍(结果见表1～2)。

表1 马钱子碱及其碱氮氧化物对斑马鱼胚胎LC50(24 h)Table．1 LC50 of brucine and brucine N-oxide tozebrafish embryos(24 h)

4．2 马钱子碱及其碱氮氧化物对斑马鱼胚胎孵化率的影响 与对照组比较，在2 000、1 000、500、200、100μmol/L质量浓度下，马钱子碱组孵化率均存在明显降低，马钱子碱氮氧化物组孵化率均高于相应浓度的马钱子碱组;而马钱子碱氮氧化物组仅在2 000、1 000、500 μmol/L质量浓度下，与对照组(C)相比有孵化率显著降低。马钱子碱及其氮氧化物在较高质量浓度2 000、1 000μmol/L孵化率间的差异存在显著统计学意义(结果见图1，B:马钱子碱;BN:马钱子碱氮氧化物;C:对照)。

图1 马钱子碱及其碱氮氧化物对斑马鱼胚胎孵化率的影响 ± s，n=10)Fig．1 Effect of brucine and brucine N-oxide on hatching rate of zebrafish embryo( ± s，n=10)

4．3 马钱子碱及其碱氮氧化物对斑马鱼胚胎成活率的影响 用500μmol/L的马钱子碱及其氮氧化物处理斑马鱼胚胎，马钱子碱氮氧化物组斑马鱼胚胎成活率在观察的各时间点均高于马钱子碱组，其差异在24及48 h时有显著统计学意义(结果见图2，B:马钱子碱;BN:马钱子碱氮氧化物)。

图2 马钱子碱及其碱氮氧化物对斑马鱼胚胎成活率的影响( ± s，n=10)Fig．2 Effect of brucine and brucine N-oxide on survival rate of zebrafish embryo( ± s，n=10)

4．4 马钱子碱及其碱氮氧化物对斑马鱼胚胎发育的影响 正常组鱼卵发育正常，48 h部分开始破膜，72 h已孵化成幼鱼。用200μmol/L的马钱子碱处理后的鱼卵发现有脊柱侧弯，心包水肿，黑色素少等现象;用相同浓度的马钱子碱氮氧化物处理斑马鱼卵，没有观察到上述发育异常现象。当马钱子碱氮氧化物浓度增加到1 000μmol/L时，有个别鱼卵出现了脊柱侧弯，心包水肿等现象(见图3)。

图3 马钱子碱及其碱氮氧化物对斑马鱼胚胎发育的影响(n=10)Fig．3 Effect of brucine and brucine N-oxide on developm ent of zebrafish em bryo(n=10)

4．5 马钱子碱及其碱氮氧化物对斑马鱼胚胎细胞凋亡的影响 吖啶橙染色后观察到马钱子碱氮氧化物组斑马鱼除了眼睛晶状体上有少量荧光表达外其它部位无明显荧光表达;马钱子碱组斑马鱼染色后荧光表达明显，主要表现在头部(大脑、小脑)、腹部、眼睛晶状体、视网膜。流式细胞仪检测结果表明，马前子碱组的细胞凋亡率明显高于对照组，而马钱子碱氮氧化物组虽然与对照组比，有显著统计学意义，但其显著低于马钱子碱组;马钱子碱组G1、C2期细胞比例高于对照组与马钱子碱氮氧化物组，而S期细胞比例则低于后两者，但未观察到组间存在显著的统计学差异(见图4～5，表3;B:马钱子碱;BN:马钱子碱氮氧化物;C:对照)。

图4 马钱子碱及其碱氮氧化物对斑马鱼胚胎细胞凋亡的影响(n=3)Fig．4 Effect of brucine and brucine N-oxide on apoptosis of zebrafish embryo(n=3)

表3 马钱子碱及其碱氮氧化物对斑马鱼胚胎24 h细胞凋亡及细胞周期的影响( ± s，n=3)Table．3 Effect of brucine and brucine N-oxide on apoptosis and cell cycle of zebrafish embryo( ± s，n=3)

表3 马钱子碱及其碱氮氧化物对斑马鱼胚胎24 h细胞凋亡及细胞周期的影响( ± s，n=3)Table．3 Effect of brucine and brucine N-oxide on apoptosis and cell cycle of zebrafish embryo( ± s，n=3)

与对照组比较，*P ＜0．05，＊＊P ＜0．01;B 与 BN 比较，##P ＜0．01。*P ＜0．05，＊＊P ＜0．01 vs control group;##P ＜0．01 B vs BN．

组别 例数 剂量/(μmol/L) 凋亡率/% 细胞周期分布/%G1期 G2期 S期对照 3 － 0．11 ± 0．08 59．95 ± 1．61 7．09 ± 1．78 32．96 ± 3．32马钱子碱 3 200 3．73 ±1．67＊＊ 71．84 ±12．92 11．79 ± 2．45 16．36 ±15．36马钱子碱氮氧化物 3 200 0．54 ±0．19*##54．75 ± 7．71 8．78 ± 4．73 36．47 ± 10．36

图5 马钱子碱及其碱氮氧化物对斑马鱼胚胎24h细胞凋亡及细胞周期的影响(n=3)Fig．5 Effect of brucine and brucine N-oxide on apoptosis and cell cycle of zebrafish embryo(n=3)

5 讨论

斑马鱼早期胚胎发育的动态表现为［6］:斑马鱼受精卵为圆形，50 min左右开始卵裂，以后每15～20 min左右卵裂一次;2．5 h后胚胎进入囊胚期，可见胚盘象一顶帽子盖在卵黄的表面;15 h后，逐渐发育为幼鱼。破膜前的幼鱼头尾相对曲卧于胶膜中，腹侧“抱着”卵黄。其眼球黑色，背腹部黑色素细胞呈斑块状，心脏为纺锤形的囊，节律性心跳明显，血液由心脏泵出，通过耳囊深部沿背血管流向体后，然后折转向前腹部，向前穿过卵黄流回心脏。消化道、泄殖孔清晰可见，尾鳍宽大，耳囊呈薄膜状，内可见两个黑色小圆点;72 h后，正常发育的幼鱼尾部剧烈摆动破膜先出，之后整个鱼体出膜。出膜的幼鱼体长约4 mm左右;1 d后常到水面游动，1周后开始捕食。但由于外界温度条件的不同，整个胚胎的发育过程会有所差异。

斑马鱼鱼卵常年可得，透明度高，发育迅速，特征明显，便于观察。斑马鱼的胚胎发育毒性试验与传统的成鱼急性毒性实验相比，具有成本低、影响因素少、易于重复性和灵敏度高等的特点，而且生命早期发育阶段通常对毒性作用最敏感。胚胎毒性实验成为成鱼急性毒性试验的有效替代手段［7］。不同作用机理的化合物在不同胚胎发育阶段内不仅毒性作用表征不同，且敏感度也会有所改变［8］。所以研究不同发育阶段的毒性效应可以为化合物毒理评价研究提供特殊的信息，如毒物最敏感的毒理学指标和最关键的暴露时间等［9］。斑马鱼对药物毒性作用呈现出与哺乳动物可比的反应。一般药物毒性研究包括急性单个剂量试验、亚慢性多个剂量组试验、慢性毒剂量试验。除了利用斑马鱼进行了一般毒性实验外，还能就如血管发生、神经毒性、肝毒性、软骨发育、生殖毒性、发育毒性、肿瘤发生等进行研究［10-14］。

本实验结果显示，在斑马鱼胚胎期和斑马鱼幼鱼期，马钱子碱的毒性远远大于马钱子碱氮氧化物。马钱子碱的半数致死量是马钱子碱氮氧化物的10～15倍。对斑马鱼胚胎发育的观察结果证实了生物转化后的马钱子碱氮氧化物毒性亦明显低于马钱子碱，与斑马鱼急性毒性实验一致。由此可见，斑马鱼作为一种模式动物，一种可实现高通量操作的脊椎动物，在中药毒性评价上有着非常重要的意义。

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