酸性染料比色法测定白芥子中总生物碱的含量

吕伟，田实民

(枣庄市药品检验所，山东 枣庄 277102)

酸性染料比色法测定白芥子中总生物碱的含量

吕伟*，田实民

(枣庄市药品检验所，山东 枣庄 277102)

目的：建立白芥子中总生物碱含量测定的方法。方法：采用酸性染料比色法测定白芥子中总生物碱含量。结果：酸性染料比色法显色的条件为pH 4.2的缓冲液10 mL，0.04 %的溴甲酚绿溶液2.0 mL，三氯甲烷萃取4次，每次5 mL，检测波长332 nm。芥子碱硫氰酸盐在1.696～16.960 μg·mL-1与吸光度呈良好的线性关系，平均回收率99.75 %，RSD=1.16 %(n=6)。结论：该方法灵敏度高，准确性，重现性好。

酸性染料比色法；白芥子；总生物碱；含量测定

白芥子为十字花科植物白芥SinapisalbaL.的干燥成熟种子，具有温肺豁痰利气、散结通络止痛的功能[1]。化学成分与药理研究表明，以芥子碱为代表的生物碱类成分是其有效部位之一[2-4]，《中国药典》采用HPLC对芥子碱含量进行控制[1]。本文首次采用酸性染料比色法，以主要有效成分芥子碱硫氰酸盐为对照品，建立白芥子中总生物碱的含量测定方法，为进一步全面控制白芥子药材质量提供实验依据。

1 仪器与试药

UV-2401PC紫外-可见分光光度计(日本岛津)，超声波药品处理机(济宁金百特电子有限公司)。芥子碱硫氰酸盐对照品(中国药品生物制品检定所，批号111702-200501)。所用试剂均为分析纯。白芥子样品，购自不同产地，经山东中医药大学石俊英教授鉴定为十字花科植物白芥SinapisalbaL.的种子。

2 方法与结果

2.1 对照品贮备液制备

精密称取芥子碱硫氰酸盐对照品10.6 mg，用pH 4.2的醋酸-醋酸钠缓冲液溶解并定容至25 mL，作为芥子碱硫氰酸盐对照品贮备液(浓度424 μg·mL-1)。

2.2 对照品溶液制备

精密量取芥子碱硫氰酸盐对照品贮备液0.5，1，2，3，5 mL，用pH 4.2的醋酸-醋酸钠缓冲液稀释至10 mL，配成5个浓度的芥子碱硫氰酸盐对照品溶液。

2.3 供试品溶液制备

取样品粉末0.5 g，精密称定，精密加入pH 4.2的醋酸-醋酸钠缓冲液100 mL，超声处理30 min，用pH 4.2的醋酸-醋酸钠缓冲液补足损失的重量，滤过，精密量取续滤液2 mL，置分液漏斗中，加入pH 4.2的醋酸-醋酸钠缓冲液10 mL，0.04 %的溴甲酚绿溶液2.0 mL，用三氯甲烷萃取4次(5，5，5，5 mL)，合并三氯甲烷萃取液，用三氯甲烷定容至25 mL。

2.4 标准曲线制备

精密量取芥子碱硫氰酸盐对照品溶液2 mL，置分液漏斗中，加入pH 4.2的醋酸-醋酸钠缓冲液10 mL，0.04 %的溴甲酚绿溶液2.0 mL，用三氯甲烷萃取4次(5，5，5，5 mL)，合并三氯甲烷萃取液，用三氯甲烷定容至25 mL，以相应试剂为空白，照紫外-可见分光光度法，在332 nm处测定吸光度值。以吸光度A为纵坐标，芥子碱硫氰酸盐浓度C为横坐标，计算标准曲线，得回归方程A=4.987 0×10-2C+7.551 5×10-2，r=0.999 8。表明芥子碱硫氰酸盐对照品浓度在1.696～16.960 μg·mL-1与所形成的酸性染料离子对的吸光度之间呈良好的线性关系。

2.5 精密度试验

精密量取芥子碱硫氰酸盐对照品溶液(浓度42.4 μg·mL-1)2 mL，按标准曲线绘制方法操作，在332 nm处连续6次测定吸光度，计算RSD=0.08 %，表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验

取同一供试品溶液，分别于0，20，40，60，80，100，120 min在332 nm处测定吸光度，计算RSD=0.15 %，表明供试品溶液在制备后120 min内稳定性良好。

2.7 重复性试验

取5号样品粉末0.5 g，6份，按样品测定方法平行测定，计算总生物碱含量，RSD=0.19 %。表明方法的重复性良好。

2.8 加样回收率试验

取5号样品(已知总生物碱含量1.487 %)粉末0.5 g，6份，精密称定，精密加入芥子碱硫氰酸盐对照品6.96 mg，按样品测定方法操作，计算加样回收率，结果见表1。

表1 总生物碱加样回收率试验

注：芥子碱硫氰酸盐对照品加入量均为6.96mg

2.9 样品中总生物碱含量测定

取不同产地样品粉末0.5 g，按2.3制备供试品溶液，以相应试剂为空白。照紫外-可见分光光度法，在332 nm处测定吸光度值，由标准曲线读出浓度C，以干燥品计算总生物碱含量，结果见表2。

表2 不同产地白芥子总生物碱含量测定 /%

注：n=3

3 讨论与小结

现有的总生物碱的含量测定方法主要有重量法、酸碱滴定法和酸性染料比色法。其中重量法和酸碱滴定法专属性差，灵敏度低，所需样品量大。酸性染料比色法测定中药中总生物碱的含量，是根据一定pH值条件下，生物碱盐的阳离子和酸性染料的阴离子定量结合生成有色的络合物(即离子对)，此离子对可以定量地被某种有机溶剂萃取的原理，通过测定萃取液的吸光度，来测定中药中总生物碱含量的方法[5]。

本文对酸性染料的种类(甲基橙、溴甲酚绿、溴酚蓝、溴麝香草酚蓝)、酸性染料的用量、检测波长、水相pH值、缓冲液的用量、试剂加入顺序、萃取条件、样品处理方法等多个实验条件进行了优化筛选。实验结果表明，芥子碱硫氰酸盐对照品与甲基橙形成的络合物在200～500 nm无特征吸收；与溴酚蓝、溴麝香草酚蓝形成的络合物及空白溶液在332、415 nm处吸收均较大；与溴甲酚绿形成的络合物在332、415 nm处吸收较大而空白溶液在332 nm吸收很小，故选择溴甲酚绿为显色的酸性染料；确定检测波长为332 nm。pH 4.0～4.4，芥子碱硫氰酸盐对照品与溴甲酚绿形成的络合物有比较稳定的最大吸光度值，故选择pH 4.2为显色的pH值。溴甲酚绿溶液用量在1.5～2.5 mL，芥子碱硫氰酸盐对照品与其形成的络合物有比较稳定的最大吸光度值，故选择2.0 mL为酸性染料的用量。缓冲液用量在8～12 mL，芥子碱硫氰酸盐对照品与溴甲酚绿形成的络合物有比较稳定的最大吸光度值，故选择缓冲液的用量为10 mL。以缓冲液-染料-三氯甲烷的顺序加入试剂操作，芥子碱硫氰酸盐对照品与溴甲酚绿形成的络合物有最大的吸光度值，故确定试剂加入顺序为缓冲液-染料-三氯甲烷。经过3次萃取，三氯甲烷已经能将生物碱酸性染料离子对提取99.9 %以上，为确保提取的充分与完全，确定萃取条件为三氯甲烷萃取4次(5,5,5,5 mL)。样品超声提取30 min或回流提取2 h以后，延长提取时间，测得总生物碱含量均不再增加；超声提取30 min与回流提取2 h的提取效果相当；超声提取更简便、省时，故确定样品的提取方法为超声提取30 min。最终确定最佳实验条件为：溴甲酚绿为显色的酸性染料，用量2.0 mL，检测波长332 nm，显色水相pH 4.2，缓冲液用量10 mL，试剂加入顺序为缓冲液-染料-三氯甲烷，萃取条件为三氯甲烷萃取4次(5,5,5,5 mL)，样品提取方法为超声提取30 min。该方法操作简便、快捷、准确、稳定性好、灵敏度高、重现性好、加样回收率高、人为误差小，可以用作白芥子的质量控制。

[1] 国家药典委员会.中国药典[S].一部.北京：中国医药科技出版社，2010：149-150.

[2] 南京中医药大学.中药大辞典[M].上册.上海：上海科学技术出版社，2006：983.

[3] 李晶，石卓，赵丽娟，等.芥子碱硫酸氢盐对自发性高血压大鼠血压和心率的影响[J].吉林中医药，2002，22(6)：55-56.

[4] 张明发，沈雅琴.芥子碱的抗炎和抗腹泻作用[J].中药药理与临床，1996，12(1)：29-31.

[5] 蒋爱芳，杨义芳，黄文武.酸性染料比色法测定总生物碱的研究进展[J].中草药，2006，37(增刊)：359-362.

DeterminationoftheTotalAlkaloidsinSemenSinapisAlbabyAcidDyeColorimetry

LÜ Wei，TIAN Shi-min

(1.ZaozhuangInstituteofDrugControl，Zaozhuang277102，China)

Objective:To investigate the method of determination of total alkaloids in SemenSinapisalba.Methods：The Contents of total alkaloids were determined by Acid dye colorimetry.Results：Acid dye color conditions：pH 4.2 buffer 10 mL，0.04 % bromocresol green liquid 2.0 mL，chloroform extraction four times，each time use 5 mL，and the wavelength was at 332 nm.The linear range of Sinapine thiocyanate was 1.696～16.960 μg·mL-1，the mean recovery was 99.75 %，RSD=1.16 % (n=6).Conclusion：This method is simple，sensitive and accurate with good reproducibility.

Acid Dye Colorimetry; SemenSinapisalba; Total Alkaloids; Determination

*吕伟，E-mail：lvwei0632@126.com

2011-01-07)