血清肌酐测定方法学的局限性及临床应用的相对性

姚艳霞

(中国核工业北京四零一医院检验科,北京102413)

血清肌酐浓度测定对临床诊断和治疗有重要意义,其测定结果必须准确可靠。目前临床使用的几种肌酐检测方法,特异性和抗干扰性各具特点,肌酐测定的参考范围也受多种因素的影响,因此就肌酐检测的方法学和参考值做以下综述。

血清肌酐浓度测定是评价肾小球滤过率(GFR)的有效指标,在急性肾功能衰竭和慢性进行性肾功衰竭时,血清肌酐测定都有助于临床判断病情,特别是儿科和肾移植病人的诊断、病程判断、疗效观察等,血肌酐连续监测的结果更具临床参考价值。但一个检验指标能否有效的在临床应用的前提是测定结果必须准确可靠,况且血肌酐测定值又是计算GFR的数学依据,只有其测定结果准确和重复性好,才能保证GFR的准确计算[1]。临床实验室已采用过的主要的肌酐测定方法已见报告的达10余种。目前临床常用的肌酐测定方法有碱性苦味酸法(又称Jaffes法)和酶学方法。这二类方法都存在非特异性等局限性。

1 碱性苦味酸法的非特异性对测定结果准确性的影响[2]

依据肌酐Jaffe's法的反应原理,凡含有甲基或亚甲基功能团的化合物均可与苦味酸发生类似反应,生成α-甲基酮或α-亚甲基酮类化合物而使结果伪阳性升高,如某些氨基酸、蛋白质、丙酮酸、抗坏血栓、丙酮、乙酸、乙酰乙酸、高浓度葡萄糖、果糖等。

Jaffé终点法为减少干扰曾采用过三氯醋酸沉淀蛋白,离心取上清液测定;也曾采用Fuller's土(漂白土)去蛋白等干扰物的方法。Jaffé两点动力学法,取测定时间(“窗时间”)t1为30秒,t2为120秒,从而避开来自“快干扰物”和“慢干扰物”的干扰。但是,有一些干扰物的反应速度与肌酐相近似,如丙酮酸、α-酮戊二酸,特别是糖尿病患者、肾病酮症酸中毒血清中酮体干扰明显,即使采用了Jaffé两点动力学方法也难于排除这部分干扰。除了伪阳性干扰外,还存在伪阴性干扰物,常见的是胆红素。胆红素会使肌酐测定结果偏低,当胆红素浓度升至35mg/dl(600umol/L)时干扰明显[3]。对此,有的肌酐试剂盒通过加入胆红素氧化酶或亚铁氰化钾予处理样品,而降低其干扰。

2 酶学方法的特异性是相对特异性[4,5]

在临床化学方法学发展中酶学方法的运用,使临床化学测定技术有了一个质的飞跃。其核心是酶作用特异性高,使测定的准确性、灵敏度、重复性、线性测量范围等都有了相应的大幅度提高。酶法提高了检测的特异性,但并非绝对特异性。虽同属酶法也各自存在不同类型和大小不一的干扰。目前临床常规化验采用较多的酶法试剂盒是肌酐酰胺水解酶偶联肌酸酶/肌氨酸氧化酶/过氧化物酶法,这种方法存在内源性肌酐的干扰,并且增加了样品中还原性物质的干扰。药物维生素C,还原型谷胱苷肽,胆红素,氢醌磺酸钙,他巴唑,α-甲基多巴苯药物剂量大时可产生伪阴性干扰,可通过加入抗坏血酸氧化酶、谷胱甘肽氧化酶及胆红素氧化酶等双试剂法去除维生素C、还原型谷胱甘肽和胆红素的干扰。

另一酶法是采用肌酐亚胺水解酶偶联谷氨酸脱氢酶反应紫外(A340nm)测定法[6,7],此法采用肌酐亚胺水解酶(creatinine deiminase,缩写为CDI)水解肌酐产生甲内酰脲和氨,再偶联谷氨酸脱氢酶(GLDH)在还原型辅酶Ⅱ(NADPH)存在下催化α-酮戊二酸与氨反应生成谷氨酸,同时NADPH氧化转化为NADP+,可监测A340 nm下降速度,以计算血清肌酐含量。从此反应原理可见样品中内源性氨是主要干扰物。葡萄糖,氨基酸也造成伪阳性干扰;总胆红素浓度达到12mg/dl(≥207 mmol/L)时产生伪阴性干扰。采用CDI作为工具酶的商品试剂盒存在的另一个重要问题是原料CDI缺乏特异性,可非特异地水解胞嘧啶相关化合物,造成测定结果伪阳性偏差。在临床治疗用的一些药物如某些抗癌药、治疗白血病、乙肝药物中含有胞嘧啶类化合物,使用这类药物治疗的患者检测血肌酐浓度时,就会造成化验结果伪阳性升高,因此消除和降低这类药物干扰应引起重视,以避免误诊。

3 方法灵敏度、线性范围对临床应用的影响

对一个方法学性能的评价除特异性,准确性之外,分析灵敏度、分析变异和线性测量范围也必须予以重视与酶法相比Jaffe终点和两点法灵敏度和线性测量范围都比较低。酶法试剂盒商家提供的资料线性测量范围低者7 080μ mol/l,高者达26 550μ mol/l,现将搜集的资料列表2。

表2 不同方法和试剂盒性能比较

一项研究证明,因Jaffe's两点动力学法线性测量范围低,在高值(肌酐浓度＞4 mmol/dl)样品 Jaffe's两点动力学法测不上去而结果比酶法偏低;但在低值(肌酐浓度＜4 mmol/dl)样品Jaffe's两点动力学法结果比酶法偏高,这是因为非特异性干扰所致。

4 生物学变异和分析变异对临床应用的影响

肌酐的生物学变异和分析变异对临床应用的影响应引起高度重视。首先是生物学变异,其中包括年龄,性别,饮食等等,大运动量的男性约升高20%,不分性别的季节律(夏季)约升高6%,昼夜(夜间)约升高 5%;55-60岁的老年人约升高5%。4-10岁儿童约降低5%;妊娠约降低6%,分析变异在手工,半自动和全自动之间也存在较大差异,当前我国执行的CLIA88允许误差范围为靶值±26.5μ mol/L或靶值±15%(取大值)。但是,在2002年北京地区 30家医院检验科生化室参加国际测量评价计划-7(IMEP-7)的回报结果与液相色谱-同位素稀释质谱(LC-IDMS)法确定的靶值74.57 μ mol/L相比,偏倚的变化范围为2.18%-38.66%,最小值为66 μ mol/L,最大值为 105.3 μ mol/L。在如此大的生物学变异和分析变异的前提下,一要做好室内质控,二要在临床应用肌酐结果时,不能只凭肌酐的一次化验结果而下定论。

5 方法间的系统误差与参考值

Jaffe终点法与Jaffe两点法之间,存在一定差异,理论上后者比前者偏低;各种酶法与Jaffe两点法之间,虽然相关良好,但存在明显的系统误差,偏倚(a)分布在16 μ mol/l-35 μ mol/L之间[8,9]。因为方法间、试剂盒原理和性能质量间存在差异,所以血肌酐参考值的报告也不尽相同,现将搜集到的部分资料列在表3。在一项最新的研究资料中报告了血清肌酐酶法测定获得的不同年龄段的参考范围,可见成人高于儿童,男女间也有差异,如表4[10]。

表3 不同方法和不同资料来源的血肌酐参考范围

表4 血清肌酐浓度参考范围

从表3表4不难看出,到底哪个参考范围更科学,准确,很难下结论,因为影响因素太多了。由此可见,在如此大的生物学变异和分析变异的前提下,参考值给出的不同方法间、性别间、年龄间的差异,其临床应用需慎重。在临床实践中,各实验室建立自己的参考范围更有必要;在临床应用中,应把肌酐测定结果与其他肾功指标及临床表现综合分析,以提高实验诊断临床应用的可靠性[11]。

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[3]张传洽,Jaffe′速率法、电极法和酶法测定肌酐结果的比较[J].国际检验医学杂志,2006,27(3):283.

[4]张 超,血清肌酐肌氨酸氧化酶法与苦味酸动力学法检测结果的比较[J].中华检验医学杂志,2006,29(6):651.

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[6]徐国宾,朱立华,夏铁安.用肌酐亚氨水解酶偶联谷氨酸脱氢酶的肌酐酶法测定[J].临床检验杂志,2001,19(3):149.

[7]梁国庆,张 萍,张 利.酶法与Jaffe′速率法检测肌酐结果的探讨[J].国际检验医学杂志,2008,29(9):864.

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[11]张建平,王治国.肌酐检测的准确性问题研究[J].国际检验医学杂志,2008,29(6):501.