盐析法从牛初乳中提取IGF-1工艺条件研究

莫继先，高学军

(1.齐齐哈尔大学生命科学与农林学院遗传工程重点实验室，黑龙江齐齐哈尔161006;2.东北农业大学乳品科学教育部重点实验室，黑龙江哈尔滨150030)

盐析法从牛初乳中提取IGF-1工艺条件研究

莫继先1，高学军2，*

(1.齐齐哈尔大学生命科学与农林学院遗传工程重点实验室，黑龙江齐齐哈尔161006;2.东北农业大学乳品科学教育部重点实验室，黑龙江哈尔滨150030)

目的:用盐析法从牛初乳中提取IGF－1，确定最佳盐析饱和度。方法:以新鲜牛初乳为原料，调脱脂乳等电点至4.2完全除去酪蛋白，收集乳清后选择不同饱和度硫酸铵盐析，SDS－PAGE、ELISA方法确定最佳盐析饱和度。结果:制备牛初乳IGF－1硫酸铵盐析饱和度为35%，产品回收率为75.338%，纯度为16.694×10－3%。结论:硫酸铵盐析制备IGF－1效率高，成本低，35%饱和度盐析时为最佳制备IGF－1的饱和度。

牛初乳，IGF－1，盐析

从牛初乳中提取各种功能蛋白质来替代人乳一直是乳品工业常用的方法，理论上，适合从牛初乳中分离纯化IGF－1的方法有很多，如盐析法、层析法、高效液相色谱法、超滤法、等电点分子筛过滤法等［1－2］。而在这些方法中，盐析法是一种高效实用、简便易操作，适合于小规模制备方案采用的方法。蛋白质在水溶液中的溶解度是由蛋白质周围亲水基团与水形成水化膜的程度，以及蛋白质分子带有电荷的情况决定的。当把中性盐加入蛋白质溶液中后，中性盐对水分子的亲和力大于蛋白质，于是蛋白质分子周围的水化膜层减弱乃至消失。同时，中性盐加入蛋白质溶液后，由于离子强度发生改变，蛋白质表面电荷大量被中和，更加导致蛋白溶解度降低，使蛋白质分子之间聚集而沉淀［3］。目前还没有用盐析法从牛初乳中制备IGF－1的报道。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

IGF－1标准品、β－酪蛋白标准品 Sigma公司;鼠抗人IGF－1，兔抗牛IGF－1，HRP－羊抗兔IgG，ECL Plus超敏发光液，BSA;其他常规试剂 均为分析纯。

稳压稳流电泳仪、电泳槽、酶标仪(Medol 680型) Bio－Rad公司;Alpha imager TM 2200凝胶成像系统 美国Alpha公司。

1.2 盐析方法

量取新鲜牛初乳离心除脂肪，得到的脱脂乳调pH至4.2，离心除酪蛋白，收集乳清，然后调pH至7.0，边搅拌边分别加入10%、20%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、70%、80%饱和度的硫酸铵盐析，常温静止1h，4℃条件下5000r/min离心15min，分别收集上清液及沉淀，SDS－PAGE测定［4－5］。

1.3 ELISA方法

将上步所收集的上清液和沉淀分别进行ELISA检测，采用改良的双抗体夹心方法，按照鼠抗人IGF－1—待测抗原—兔抗牛IGF－1—HRP标记的羊抗兔IgG顺序进行操作，最后加显色底物TMB，H2SO4终止反应。经450nm酶标仪测定，记录结果，根据绘制的标准曲线得出各检测样品中IGF－1的含量。

2 结果与分析

2.1 SDS－PAGE测定各盐析饱和度下杂蛋白沉淀情况

盐析条件选取饱和度分别为10%、20%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、70%、80%的硫酸铵溶液，分别对应图1、图2中1～11泳道。上清液与沉淀的电泳图说明盐析饱和度在30%～35%和50%～55%两个区间时有大量沉淀。

图1 不同饱和度硫酸铵盐析沉淀后上清电泳图

图2 不同饱和度硫酸铵盐析沉淀电泳图

2.2 各盐析饱和度蛋白沉淀增加量曲线

对各组蛋白沉淀用PBS溶解，测定溶液中蛋白浓度，计算各组中实际蛋白沉淀的总量。图3是500mL脱脂牛初乳在不同硫酸铵盐析饱和度时蛋白沉淀增加量的曲线图。由图中可以看出，在硫酸铵盐析饱和度为35%附近时蛋白沉淀增加量为最大，增加量为16544.4mg，说明此时盐析饱和度效率最高。

图3 盐析蛋白沉淀增加量曲线

2.3 ELISA法确定最佳盐析饱和度

2.3.1 IGF－1标准曲线的建立 配制不同浓度IGF－1标准品溶液，经450nm酶标仪测定，结果如图4。

图4 IGF－1标准品吸光度标准曲线

2.3.2 牛初乳IGF－1含量的测定 根据标准曲线计算，500mL牛初乳盐析后各上清液及沉淀中IGF－1含量如图5所示。由图可以看出，30%～40%盐析饱和度区间实际盐析效率基本一致。

图5 各上清液及沉淀中IGF－1含量图

2.3.3 最佳盐析饱和度的确定 根据图3，在硫酸铵盐析饱和度为35%时，杂蛋白相对沉淀量出现最大，再根据图5说明在此饱和度下的上清液中保留有绝大部分的IGF－1，少量随杂蛋白沉淀。沉淀中的IGF－1经过PBS溶液洗脱几乎可以全部回收。而在50%～55%盐析饱和度沉淀中，IGF－1随杂蛋白一起有较大量沉淀，不利于回收目的蛋白，且硫酸铵用量也较大，故综合以上考虑，35%硫酸铵盐析饱和度为实验最佳盐析饱和度。

2.4 牛初乳IGF－1纯度及回收率

ELISA方法测定脱脂牛初乳中的牛初乳IGF－1的浓度为1.601μg/mL，计算得到500mL的牛初乳中IGF－1的含量为800.500μg;35%盐析饱和度上清液共600mL，浓度 6.021mg/mL，经透析浓缩后体积50mL，浓度为72.252mg/mL，ELISA检测目的蛋白浓度为12.062μg/mL，计算目的蛋白含量为603.078μg。所以，35%硫酸铵饱和度盐析的回收率是75.338%，纯度是 16.694×10－3%，较脱脂牛初乳提高了约15～20倍，较牛初乳原液提高了约20～25倍。

3 讨论

加硫酸铵盐析之前应先将所制备的乳清进行适当的稀释，因为蛋白浓度过高，盐析时容易发生共沉的现象而影响实验结果。低饱和度盐析时，大分子蛋白质由于分子质量较大，少量聚集就会发生沉淀，而牛初乳IGF－1是小分子蛋白质，只有大量聚集才能沉淀，因而析出的牛初乳IGF－1较少。继续增加硫酸铵盐析的饱和度，当达到35%时，沉淀的大分子量蛋白质的量继续增加，同时牛初乳IGF－1也开始大量沉淀;分析图1～图3可知，当硫酸铵盐析的饱和度增大到60%时，几乎能将乳清中的所有牛初乳IGF－1析出。继续增大硫酸铵盐析的饱和度，对结果没有明显的影响，但工业生产上增大硫酸铵盐析的饱和度会造成试剂的浪费。所以选择35%的硫酸铵盐析饱和度。沉淀的蛋白质经缓冲液洗脱仍可以将目的蛋白洗脱出，这样保证了低饱和度的盐析条件即可以将杂蛋白除去，又可以将目的蛋白回收。

随着越来越多天然蛋白质的发现，功能蛋白质的制备甚至产业化将会得到快速发展。硫酸铵盐析法在蛋白质的粗提过程中效率很高，并且成本很低。目前国内还没有用此方法生产IGF－1的企业，所以利用硫酸铵盐析生产IGF－1将在未来蛋白质制备中前景广阔。

［1］Francis G L，et al.Purification and partial sequence analysis of insulin－like growth factor－1 from bovine colostrum［J］.Biochem，1986，233:207－213.

［2］Bernardinelli SE，Bottaro Castilla HR，Waehner RS，et al.Production and properties of the milk－clotting enzyme［J］.Rev Argent Microbiol，1983，15(2):95－104.

［3］高娃.硫酸铵的盐析作用［J］.内蒙古教育学院学报，2000，13(9):45－46.

［4］Denisova II，Krasheniuk AI，Azhitskiǐ GIu，et al.Isolation and purification of lactoperoxidase from cow＇s milk［J］.Vopr Med Khim，1986，32(1):116－119.

［5］汪家政.蛋白质技术手册［M］.科学出版社，2000，8.

Study on the technological conditions of extracting IGF－1 from bovine colostrum by salting－out

MO Ji－xian1，GAO Xue－jun2，*
(1.College of Life Sciences and Agriculture and Forestry，Qiqihar University，Qiqihar 161006，China;2.Key Laboratory of Dairy Science of Ministry of Education，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China)

Objective:The IGF－1 was extracted from bovine colostrum by salting－out to find the optimum concentration of salting－out.Methods:Experimental material was fresh bovine colostrum，adjusted the isoelectric point of skim milk to 4.2，removed the casein completely，and then recovered whey，chose a different concentration of ammonium sulfate saturation，used SDS－PAGE，ELISA method to determine the optimum concentration of salting－out.Results:The ammonium sulfate saturation was 35%in the preparation of bovine colostrum IGF－1，the product recovery rate was 75.338%，the purity was 16.694×10－3%.Conclusions:The optimum concentration of salting－out was 35%.

bovine colostrum;IGF－1;salting－out

TS252.1

B

1002－0306(2011)04－0309－03

2010－03－25 *通讯联系人

莫继先(1982－)，男，硕士，从事生物化学与分子生物学方面的研究。

黑龙江省科技厅攻关项目(GA06B201－4)。