酵解拟黑鑫刺蚁制备抗氧化活性肽

王 婧，刘通讯

(华南理工大学轻工与食品学院，广东广州510640)

WANG Jing，LIU Tong－xun*

(College of Light Industry and Food Science，South China University of Technology，Guangzhou 510640，China)

酵解拟黑鑫刺蚁制备抗氧化活性肽

王 婧，刘通讯*

(华南理工大学轻工与食品学院，广东广州510640)

分别采用Alcalase 2.4L、木瓜蛋白酶、复合蛋白酶、风味蛋白酶、胰酶水解拟黑多刺蚁，利用超氧自由基、DPPH自由基、羟基自由基清除能力、还原力、铁离子螯合能力、亚油酸自氧化抑制能力6个指标衡量水解物的抗氧化能力，并结合水解度(DH)、蛋白质利用率、多肽含量等理化指标筛选最适蛋白酶。结果表明，酶解物具有良好的体外抗氧化活性，其抗氧化活性与抗氧化肽的剂量呈正相关，其中Alcalase 2.4L水解能力、酶解液抗氧化能力最强。还研究了热处理、超声、均质等预处理方式对水解能力、抗氧化能力的影响，发现均质对酶解产物的影响最大。

拟黑多刺蚁，抗氧化作用，水解度(DH)，自由基

WANG Jing，LIU Tong－xun*

(College of Light Industry and Food Science，South China University of Technology，Guangzhou 510640，China)

自Harman提出自由基理论后，人们意识到体内氧化产生的自由基与人的衰老和许多疾病有关［1］。化学抗氧化剂毒副作用的制约使人们把目光逐步转向从各种动植物组织中提取的天然抗氧化剂，筛选具有强抗氧化活性的天然资源已成为研究的新趋势。天然抗氧化肽(主要为肌肽和谷胱甘肽)含量很低，酶法水解条件温和、降解位点特异性和重复性高、对产物活性破坏小，己经成为制备生物活性肽的主要方向。拟黑多刺蚁是研究最多、应用最广的药食两用蚁，具有免疫调节、壮阳补肾、抗炎镇痛、活血化瘀、抗应激抗肿瘤、抗疲劳抗衰老、降低胆固醇等多种药理作用，但目前国内外对拟黑多刺蚁水解物抗氧化作用的研究还未见报道。本研究采用酶法水解制备拟黑多刺蚁抗氧化肽，以期为拟黑多刺蚁的深度开发及抗氧化肽的研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

拟黑多刺蚁蚁干 产地云南，粉碎，过40目筛，备用;碱性蛋白酶(Alcalase 2.4L)、复合蛋白酶、风味蛋白酶 诺维信公司;木瓜蛋白酶 广州裕立宝国际有限公司;胰酶 E.Merck公司;牛血清蛋白 北京华达杰瑞公司;福林酚 鼎国生物公司;其他化学试剂 均为分析纯。

凯氏定氮仪 北京思贝得机电技术研究所;PHS－3C精密 pH计 上海雷磁仪器厂;SpectrumLab22PC分光光度计 上海棱光技术有限公司;SS350多功能食物搅拌机 佛山市顺德区容桂家成电器厂;水浴恒温振荡器 金坛市宏华仪器厂;PYX－190S－A生化培养箱 KELI科力仪器厂;SHZ－D(Ⅲ)循环水式真空泵 巩义市英峪予华仪器厂;T25数显型分散机 德国IKA;ALPHA1－4/2－4冷冻干燥机 德国Christ;JY92－II超声波细胞粉碎仪

宁波新芝生物科技股份有限公司;金怡85－1磁力搅拌器 江苏省金坛市医疗仪器厂;CN62M/802B低速台式离心机 北京中西远大科技有限公司。

表1 酶解条件及酶活数据

表2 不同抗氧化肽理化性质

1.2 实验方法

1.2.1 酶活 福林酚法GB/T 23527－2009。

1.2.2 抗氧化肽制备

1.2.2.1 酶解 称取6g蚂蚁粉配制底物浓度6%的水溶液(w/w)，升温至酶解温度后用 1mol/L的NaOH调节pH，加入2%的酶(E/S)，保持pH恒定1h，酶解4h后沸水浴10min灭酶，4000r/min离心20min，抽滤，冷冻干燥。测定其理化指标及抗氧化指标选定最适蛋白酶，并考察预处理及酶解过程中pH调节对该酶酶解效果的影响。热处理:90℃，15min;超声:工作频率 20kHz，功率 400W，超声25min，其中工作时间5s，间歇时间5s;均质:20000r/min，10min;不调pH:加酶后不调pH。

1.2.2.2 水浸提 称取6g蚂蚁粉配制底物浓度6%的水溶液(w/w)，搅拌0.5h，4000r/min离心20min，抽滤，冷冻干燥。

1.2.3 理化指标 蛋白质:凯氏定氮法GB/T5009.5－2003;水解度［2］:甲醛法;多肽:福林酚法。

1.2.4 抗氧化指标 将各抗氧化肽冻干粉配制成不同浓度的水溶液测定其抗氧化性。

1.2.4.1 羟自由基清除率［3］分别测定0.25、0.5、0.75、1mg/mL样品的清除率。

1.2.4.2 DPPH·清除率［4］分别测定0.2、0.3、0.4、0.6mg/mL样品的清除率。

1.2.4.3 还原力测定［5］分别测定 2、4、6、20mg/mL样品的还原力。

1.2.4.4 铁螯合能力［6］分别测定 1、2、4、8mg/mL样品的螯合能力。

1.2.4.5 超氧自由基清除能力［7］取0.1mol/L Tris－HCl缓冲液(pH8.2，含 2mmol/L EDTA)4.5mL于25℃水浴保温20min，加入一定体积3mmol/L的邻苯三酚(实验前于25℃保温)和同体积的蒸馏水，迅速摇匀，每隔30s测一次A325nm值，绘制时间与吸光度间的坐标图，计算自氧化速率V1，将其控制在0.050～0.065A/min范围内，线性时间为4.5min，以样品代替蒸馏水测得 V2。分别测定 4、10、15、20mg/mL 样品的清除率。

1.2.4.6 亚油酸自氧化速率抑制作用 2mL样品中加入0.1mol/L pH7.0的磷酸盐缓冲液2mL、2.5%的亚油酸无水乙醇溶液2mL，同时以蒸馏水代替样品做空白对照，混匀后60℃避光密封放置5d，样品添加量分别为 0.016、0.08、0.4、2mg/mL。采用硫氰酸铁法［8］测定脂质过氧化程度。

1.2.5 统计分析 绘制清除率与酶解物含量的二元一次方程，计算其IC50;利用SPSS对不同浓度各酶解物的清除率进行F检验，对理化指标及IC50进行T检验，对调节pH和不调节pH时酶解物的抗氧化能力进行配对比较，α=0.05。

2 结果与分析

2.1 酶活测定

见表1。

2.2 不同抗氧化肽理化性质

从表2可以看出，酶解提高了氨基态氮含量、多肽含量、蛋白质中多肽所占比例及蛋白质利用率，除蛋白质中多肽所占比例略小外，碱性蛋白酶酶解液理化指标最高。

2.3 不同抗氧化肽抗氧化

蛋白质酶解过程中，可解离基团数目增加，导致亲水性和净电荷数增加，分子结构改变使原本埋藏的疏水中心暴露到溶液环境中。这种结构改变相应带来功能特性和生物活性的改变，从而使肽段具备螯合金属离子、清除自由基和促进过氧化物分解等作用［9］。

从表3、图1可以得出，除了亚油酸自氧化抑制作用远高于抗氧化剂外，酶解物其他各项抗氧化指标均低于抗氧化剂;水浸提液超氧自由基清除能力最强，其次碱性蛋白酶、胰酶;水浸提液羟基自由基清除能力最高，其次胰酶、碱性蛋白酶;水浸提液DPPH自由基清除能力最强，其次木瓜蛋白酶、风味蛋白酶;浸提液还原力最强，其次风味蛋白酶、木瓜蛋白酶;碱性蛋白酶铁螯合能力最强，其次胰酶、复合蛋白酶;碱性蛋白酶抑制亚油酸自氧化的能力最强，其次为木瓜蛋白酶、胰酶。从图1还可以看出，VC前期抗氧化作用甚至优于酶解物，但作用时间短暂，只能起到短时间的抗氧化作用。

表3 不同抗氧化肽抗氧化能力(以IC50表示，mg/mL)

表4 不同处理方式对碱性蛋白酶酶解物理化性质的影响

表5 不同处理方式对碱性蛋白酶酶解物抗氧化能力的影响(以IC50表示，mg/mL)

图1 不同抗氧化肽(0.016mg/mL)对亚油酸自氧化的抑制作用

结合抗氧化肽的理化性质，选取碱性蛋白酶为最适蛋白酶。碱性蛋白酶对疏水性氨基酸有较强的专一性，主要形成含有疏水性氨基酸末端的肽段，多数已确定结构的抗氧化肽N－端或C－端含有疏水性氨基酸或His－，此外，疏水性氨基酸能加强抗氧化肽与多不饱和脂肪酸的相互作用，通过与氧结合或捕捉脂质自由基，延缓脂质过氧化链反应［10］。也有学者认为抗氧化肽抑制亚油酸自氧化作用的主要原因不是清除自由基，而是在油分子周围形成界面膜，防止促脂质氧化因子渗透油分子，从而抑制油脂氧化［11］。

2.4 不同处理方式对碱性蛋白酶酶解物理化性质的影响

蛋白质变性的实质是维持蛋白质高级结构的次级键遭到破坏造成天然构象解体，蛋白质分子变为无秩序的肽链状态，暴露出了包藏在分子内部的活性部位，有利于酶解的进行。热变性的机制是在较高的温度下，肽链受过分的热振荡而导致次价键遭到破坏，使原来的空间结构发生改变［12］。超声波主要通过空化作用、机械作用、热作用，使拟黑多刺蚁干粉收缩、膨胀甚至破碎，蛋白质变性，生物分子解聚，同时加速了有效成分的扩散［13］。均质处理的机制是利用高速旋转的转子产生强剪切力、液力冲击、涡流撕裂，使物料较快的细化，并使蛋白质分子空间结构被一定程度破坏，发生定向的再结合，形成多孔的蛋白结构［14］。

从表4可知，三种预处理方式均增加了酶解液的氨基态氮含量和水解度;超声和均质增加了蛋白质含量、多肽含量及蛋白质中多肽所占比例，但热处理则相反;仅均质增加了蛋白质利用率;随着酶解的不断进行，酶解液pH不断降低，酶解过程中不调控pH时，水解度略微增加，可能是碱性蛋白酶最适pH低于8.0，可溶性蛋白质含量随pH的增大而增大，故蛋白质利用率降低。

2.5 不同处理方式对碱性蛋白酶酶解物抗氧化能力的影响

从表5、图2可以看出，除超声处理铁螯合能力略有下降外，三种预处理方式均提高了酶解液抗氧化能力;均质处理除DPPH自由基清除能力稍逊热处理外，其他抗氧化指标均高于其他处理方式，而超声效果最差;不调pH除DPPH自由基清除能力、还原力外，其他抗氧化指标均低于调节pH的。

2.6 酶解物含量与抗氧化性

从表6可以看出，抗氧化肽抑制亚油酸自氧化能力随抗氧化肽含量的增大而增大，但不同浓度下各抗氧化肽抑制能力强弱顺序并不相同，其他抗氧化指标均呈现该现象。

2.7 显著性分析

F检验表明酶种类、处理方式及酶解物含量对酶解物抗氧化作用具有显著性影响。T检验显示除亚油酸自氧化抑制作用外，酶解对拟黑多刺蚁理化指标和抗氧化作用有显著性影响;碱性蛋白酶酶解液理化指标中仅蛋白质利用率显著高于其他蛋白酶酶解液外，除羟自由基外，该酶解液抗氧化性与其他酶解液有显著性差异;除DPPH清除能力外，预处理方式对酶解液各项指标均无显著性影响;均质处理除显著性提高了亚油酸自氧化抑制作用、DPPH清除能力外，理化性质与抗氧化性与其他预处理方式无显著性差异;除铁螯合能力外，调节pH的酶解液抗氧化能力显著优于不调pH时。

表6 不同抗氧化肽对亚油酸自氧化的抑制作用(第5d吸光度，A)

图2 不同处理方式对碱性蛋白酶酶解物(0.016mg/mL)抑制亚油酸自氧化作用的影响

3 结论

3.1 拟黑多刺蚁酶解物具有良好的体外抗氧化活性，与木瓜蛋白酶、复合蛋白酶、风味蛋白酶、胰酶相比，碱性蛋白酶Alcalase 2.4L水解能力、酶解液抗氧化能力最强。

3.2 热处理、超声、均质三种处理方式均显著提高了拟黑多刺蚁水解度，除超声处理铁螯合能力略有下降外，三种预处理方式均提高了酶解液抗氧化能力。均质处理除DPPH自由基清除能力稍逊热处理外，其他抗氧化指标均高于其他预处理方式，而超声效果最差。

3.3 对比酶解过程中调节pH与否对酶解产物的影响，发现其对水解度和抗氧化活性影响较小，而且不调节pH会降低蛋白质利用率。

3.4 酶解物抗氧化性与剂量呈正相关，但不同浓度下各酶解物抗氧化能力强弱顺序并不相同。

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Preparation of antioxidant peptides from Polyrhachis vicina Roger by enzymatic hydrolysis

Polyrhachis vicina Roger was hydrolyzed by Alcalase 2.4L，papain，protamex，flavourzyme and pancreatin respectively.Six indexes including the scavenging activities of superoxide radical，DPPH · and hydroxyl radical，reducing power，Fe2+chelating ability，inhibitory ability against oxidation of linoleic acid were used to evaluate antioxidant activity of enzymatic hydrolysates.The protease was optimized by the index such as degree of hydrolysis(DH)，yield of protein and peptides content，as well as the antioxidant activity.The results showed that enzymatic hydrolysates had good in vitro antioxidative activity，which was positively correlated with the amount of peptide content.Among the enzymes，alcalase 2.4L showed highest hydrolytic and antioxidant ability.The influences of heat，ultrasonic treatment and homogenization on the hydrolytic ability and the antioxidant ability of the resultant hydrolysates were measured，and the results showed that homogenization had the greatest impact on enzymatic hydrolysates.

Polyrhachis vicina Roger;antioxidant activity;degree of hydrolysis(DH);radical

TS201.2

B

1002－0306(2011)06－0260－04

2010－06－28 *通讯联系人

王婧(1986－)，女，在读硕士，研究方向:粮食、油脂及植物蛋白工程。