碱提酸沉法提取紫花苜蓿干草叶蛋白初探

许英一，李 红，杨伟光，任 健，王晓杰

(1.齐齐哈尔大学食品与生物工程学院，黑龙江齐齐哈尔161006;2.黑龙江省普通高校齐齐哈尔大学农产品加工重点实验室，黑龙江齐齐哈尔161006;3.黑龙江省畜牧研究所牧草育种室，黑龙江齐齐哈尔161000)

碱提酸沉法提取紫花苜蓿干草叶蛋白初探

许英一1，2，李 红3，杨伟光3，任 健1，2，王晓杰1，2

(1.齐齐哈尔大学食品与生物工程学院，黑龙江齐齐哈尔161006;2.黑龙江省普通高校齐齐哈尔大学农产品加工重点实验室，黑龙江齐齐哈尔161006;3.黑龙江省畜牧研究所牧草育种室，黑龙江齐齐哈尔161000)

以北方寒冷地区紫花苜蓿干草为材料，将苜蓿干草粉碎后，采用碱提酸沉法提取苜蓿叶蛋白，并对提取的叶蛋白进行氨基酸含量的测定分析。本实验设计了料水比、pH、搅拌时间三个单因素进行碱提实验，并在单因素基础上设计了正交实验。正交实验结果表明，碱提法的最佳工艺条件为:料水比为1∶35，pH为10，搅拌时间为12min。在最佳碱提实验的基础上进行酸沉，通过单因素实验，确定酸沉的最佳条件为提取液pH=4.2。此时样品粗蛋白含量为59.76%，粗蛋白提取率为42.52%。通过氨基酸分析结果表明，苜蓿叶蛋白氨基酸种类齐全，含量高，氨基酸比例协调，因此苜蓿叶蛋白是优质蛋白质。

苜蓿，叶蛋白，碱提酸沉，氨基酸

目前，发展中国家都面临着蛋白质危机。据统计，我国每年短缺2000t［1］。苜蓿乃“牧草之王”，产量大，价格低廉，其粗提物－叶蛋白不仅蛋白质含量高，包含人和动物全部必需氨基酸和一些稀有氨基酸，而且富含胡萝卜素、多种维生素和微量元素，营养丰富且有降血压、血脂及胆固醇等多种生理功能，将其开发为保健品原料前景诱人，具有潜在的经济效益和社会效益［2］(如推动饲料工业、畜牧业和食品工业的发展，带动饮食结构的改变等)。本实验采用碱提酸沉法对苜蓿干草叶蛋白的最佳提取工艺进行了研究，同时对苜蓿叶蛋白粉进行氨基酸分析，以期为苜蓿叶蛋白的应用开发提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

紫花苜蓿干草 黑龙江省畜牧研究所提供;氯化钠、盐酸、氢氧化钠、硫酸铜、硫酸钾、浓硫酸、无水碳酸钠、硼酸、无水乙醇 均为分析纯。

FW－80型微型高速万能试样粉碎机 天津市泰斯特仪器有限公司;80－1台式低速离心机 江苏省金坛市医疗仪器厂;SHB－3循环水多用真空泵 郑州杜甫仪器厂;HH－4数显恒温水浴锅 金坛市富华仪器有限公司;124S电子天平 北京赛多利斯仪器系统有限公司;SXCL－4型加热磁力搅拌器 郑州佳创仪器设备有限公司;722N可见分光光度计 上海精密科学仪器有限公司;PHS－25(数显)pH计 上海精密科学仪器有限公司;FD－1真空冷冻干燥机上海豫康科教仪器设备有限公司;L－8900全自动氨基酸分析仪 日本日立高新技术株式会社。

1.2 实验方法

1.2.1 实验设计

1.2.1.1 苜蓿叶蛋白碱提的工艺条件优化 根据蛋白质的絮凝特性，实验着重考察料水比、pH、搅拌时间三个主要影响因素。在单因素实验的基础上，选用L9(34)正交实验设计对碱提苜蓿叶蛋白的工艺条件进行优化。因素水平表见表1。

表1 正交实验因素水平表

1.2.1.2 苜蓿叶蛋白酸沉的工艺条件优化 采用苜蓿叶蛋白碱提的最优工艺条件提取蛋白质上清液，分别用0.01mol/L HCl缓慢调其pH至2.0、3.0、3.6、3.8、4.0、4.2、4.4、4.6、4.8、5.0、5.5、6.0，于 70℃ 水浴8min，离心，测定沉淀前后上清液中蛋白质的含量，计算苜蓿叶蛋白的沉淀率。

1.2.1.3 氨基酸含量分析 采用氨基酸全自动分析仪(日立L－8900型)测定。

1.2.2 叶蛋白的提取方法 工艺流程:

1.2.3 测定方法 蛋白质含量测定采用微量凯氏定氮法［3］。

氨基酸分析:采用氨基酸全自动分析仪(日立L－8900型)测定，样品处理经6mol/L HCl 105℃水解24h，测定苜蓿干草和粗蛋白含量最高的叶蛋白提取物中的17种氨基酸含量。

1.2.4 计算公式 粗蛋白提取率(%)=提取液中粗蛋白的含量/试样中粗蛋白的含量×100%

沉淀率(%)=(酸沉前上清液中粗蛋白的含量－酸沉后上清液中粗蛋白的含量)/酸沉前上清液中粗蛋白的含量×100%

2 结果与分析

2.1 苜蓿叶蛋白碱提的工艺条件优化

由表2极差分析结果可得出，按照极差R的大小，影响粗蛋白提取率的主次因素的顺序为A(料水比)>C(搅拌时间)>B(pH)，通过正交实验确定最佳组合为A3B2C3，即料水比为1∶35，pH为10，搅拌时间为12min。由方差分析表3可知，料水比对粗蛋白提取率显著影响(α=0.05)，其次是搅拌时间，pH对粗蛋白提取率影响最小，这与极差分析的结果一致。由粗蛋白提取率大小还可以看出，正交表中直观表现最佳组合为A2B2C3，与正交结果不符，进行验证实验后得出，组合A3B2C3的粗蛋白提取率为42.52%，大于A2B2C3的粗蛋白提取率，说明通过正交实验能够得到最佳的实验组合。

表2 苜蓿叶蛋白碱提的正交实验结果与极差分析

表3 正交实验方差分析

2.2 苜蓿叶蛋白酸沉的工艺条件优化

由图1可知，pH为4.2时的沉淀率最高，因此我们选用蛋白质酸沉淀时的pH为4.2。

图1 pH对苜蓿叶蛋白沉淀效果的影响

2.3 氨基酸分析

根据测定(见表4和表5)，苜蓿叶蛋白氨基酸种类齐全，含量高，氨基酸比例协调，是一种高效的植物蛋白饲料。

由表5可知，苜蓿叶蛋白中必需氨基酸的含量丰富，必需氨基酸含量占氨基酸总含量的46.58%，必需氨基酸与非必需氨基酸含量的比值为0.87，将苜蓿叶蛋白浓缩物中的必需氨基酸含量占氨基酸总含量的比值与国际通用FAO/WHO标准对比分析，其必须氨基酸含量均高于FAO/WHO标准，必需氨基酸含量占氨基酸总含量的百分比和必需氨基酸与非必需氨基酸含量的比值分别高于FAO/WHO标准规定的40%和0.6［4］。因此苜蓿叶蛋白可以提供优质蛋白质。

表4 苜蓿叶蛋白浓缩物中非必需氨基酸含量(%)

表5 苜蓿叶蛋白中必需氨基酸的含量

3 结论与讨论

3.1 本研究采用碱提酸沉法确定了苜蓿干草叶蛋白碱提的最佳工艺条件为:料水比为1∶35，pH为10，搅拌时间为12min。酸沉的最佳条件为提取液pH=4.2。此时样品粗蛋白含量为59.76%，粗蛋白提取率为42.52%。

3.2 通过氨基酸分析结果表明，苜蓿叶蛋白中必需氨基酸的含量丰富，必需氨基酸含量占氨基酸总含量的46.58%，必需氨基酸与非必需氨基酸含量的比值为0.87，分别高于FAO/WHO标准规定的40%和0.6 。因此苜蓿叶蛋白可以提供优质蛋白质。

3.3 苜蓿提取完后，剩余的棕色液化学成分的分析，以及草渣等最优利用问题，尚需进一步研究。

［1］阎娥，范月君，谢春花.苜蓿叶蛋白提取效果及叶蛋白氨基酸组成的研究［J］.青海师范大学学报，2006(1):66－68.

［2］李明元，文李铃，杜小琴.可食苜蓿叶蛋白提取工艺研究［J］.西南师范大学学报，2008，30(3):69－72.

［3］张水华.食品分析［M］.北京:中国轻工业出版社，2007:159－160.

［4］FAO/WHO.Energy and protein requirements.FAO Nutrition Meeting Report series［J］.Roma:FAO，1793:52－63.

Study on preparation of leaf protein from alfalfa hay by alkali extraction and acid precipitation

XU Ying－yi1，2，LI Hong3，YANG Wei－guang3，REN Jian1，2，WANG Xiao－jie1，2
(1.College of Food and Biotechnology，Qiqihar University，Qiqihar 161006，China;2.Key Laboratory of Processing Agricultural Products of Heilongjiang Province，Qiqihar University，Qiqihar 161006，China;3.Technical Office of Forage Breeding，Institute of Animal Husbandry of Heilongjiang Province，Qiqihar 161000，China)

Based on alfalfa hay in northern cold areas as experiment material，alfalfa hay was crushed，leaf protein was extracted by alkaline extraction and acid precipitation，and the content of amino acid was analyzed.Three single factors such as feed water ratio，pH value and stirring time in alkaline extraction experiment were designed.Through orthogonal test，the results show the optimal conditions for alkaline extraction were as follows:feed water ratio of 1∶35，pH value of 10，stirring time for 12 minutes.On the basis of the best alkaline extraction experiment，through single－factor experiments，the best condition for acid precipitation was pH4.2.Crude protein content of samples was 59.76%，extracting rate of soluble protein was 42.52%.Amino acids analysis was employed，the results showed that the type of amino acids in leaf protein from alfalfa was complete，high content，and the proportion coordination of amino acids.Therefore，leaf protein from alfalfa is a kind of high quality protein.

alfalfa;leaf protein;alkali extraction and acid precipitation;amino acids

TS201.2+1

B

1002－0306(2011)06－0264－03

2010－03－09

许英一(1971－)，女，副教授，硕士，主要从事食品教学与研究工作。

黑龙江省教育厅科学技术研究项目(11541403)。