微生物合成共轭亚油酸机理的研究进展

周 倩，刘 佩，李海霞，阮 晖，何国庆

(浙江大学生物系统工程与食品科学学院，浙江杭州 310029)

微生物合成共轭亚油酸机理的研究进展

周 倩，刘 佩，李海霞，阮 晖，何国庆*

(浙江大学生物系统工程与食品科学学院，浙江杭州 310029)

相比于共轭亚油酸(CLA)的化学合成，微生物合成CLA与化学法具有培养灵活、对设备要求低、产物分离简单等优势。主要讨论了微生物合成CLA的研究进展，亚油酸(LA)能被微生物转化的原因，以及微生物合成CLA的机理。CLA的合成机理从微生物在动物瘤胃内混合发酵代谢LA和单一微生物在体外合成CLA两方面进行阐述。

共轭亚油酸，亚油酸，蓖麻油酸，微生物合成机理

共轭亚油酸(Conjugated linoleic acid，简称CLA)是人体必需脂肪酸亚油酸(Linoleic acid，简称LA)的一组位置和构象异构体的总称，是含有顺式或反式共轭双键的十八碳二烯酸。其中，具有生理活性的只有顺9，反11－CLA(c9，t11－CLA)和反10，顺12－CLA(t10，c12－CLA)两种［1］。c9，t11－CLA又被命名为瘤胃酸，广泛存在于人类和动物体内。随着大量动物及体外实验的进行，对CLA的研究日渐深入，人们发现CLA具有抗癌、抗心血管疾病、抗糖尿病、减肥、免疫调节等［2］诸多生理功能。

1 微生物合成CLA

CLA的合成主要有化学法和微生物法两种。根据反应机理的不同，化学法可分为∶碳负离子历程、碳正离子历程、自由基历程、加成消除历程、Ⅷ族金属或其化合物催化的共轭化等［3］。但是，化学合成法会不可避免地产生一系列CLA异构体混合物、饱和或不饱和脂肪酸;虽操作成本较低，但分离效率差，需要多次反复操作，活性CLA提纯工艺繁琐［2］。

微生物合成CLA相比具有很多优势，微生物培养灵活、不需要高温高压环境;产物分离简单，通常微生物只专一合成特定的具有生理活性的CLA异构体［4－5］。

1.1 菌株

合成CLA的微生物包括瘤胃菌、乳酸菌、丙酸菌等三大类。瘤胃菌主要是溶纤维丁酸弧菌(Butyrivibrio fibrisolvens)，可以将LA转化为以c9，t11－CLA异构体为主的混合物［3，6］。但溶纤维丁酸弧菌需要严格厌氧培养，且合成的异构体种类复杂，限制了在工业生产上的应用。

乳酸 菌 包 括 嗜 酸 乳 杆 菌 (Lactobacillus acidophilus)、德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii ssp.bulgaricus)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、短乳杆菌(Lactobacillus brevis)、绿色乳杆菌(Lactobacillus viridescens)、乳酸杆菌(Lactobacillus lactis)和短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)等。乳酸菌是比较理想的菌种，它含有的亚油酸异构酶(Linoleic acid isomerase，简称LAI)可以将LA转化为具有生物活性的CLA异构体，且产物分离简单，已得到广泛应用。Lin等［7］认为在培养液中添加适量乳糖和果糖有利于促进乳酸菌CLA的合成。Yoon－Seok Song等［8］通过逐步增加LA浓度，提高短双歧杆菌(B.breve)的LA耐受性，从而达到提高CLA产量的目的。

费氏丙酸菌(Propionibacterium freudenreichii)是主要的CLA合成丙酸菌菌株。Li－Min Wang等［9］发现，费氏丙酸菌(P.freudenreichii ssp.shermanii和P.freudenreichii ssp.freudenrei－chii)在SLM、MRS、脱脂乳培养基中均能合成CLA。梁新乐等［10］对费氏丙酸菌HZ－P－35进行细胞高密度培养，极大地提高了CLA产量。

1.2 底物

已发现可用于微生物合成 CLA的底物包括∶LA、蓖麻油酸(Ricinoleic acid，简称RA)、蓖麻油、葵花籽油、豆油、紫花苜蓿种籽油、红花籽油等。其中，以LA为底物最常见，也是研究得较深入的。

研究表明，含羟基脂肪酸是LA转化合成CLA的中间产物。因此，蓖麻油酸(带有C12羟基)也可以被乳酸菌利用，转化为CLA［11］。蓖麻油中含有丰富的蓖麻油酸(约占总脂肪酸含量的88%)，但主要以甘油三酰形式存在，不能被直接利用，需要通过脂酶水解成游离蓖麻油酸［12］。

李有超［13］等研究了植物乳杆菌(L.plantarumANCLA 01)体外发酵添加葵花籽油的瘤胃液，优化提高了CLA产量。Li－Min Wang［9］等研究表明，费氏丙酸菌(P.freudenreichii)具有转化葵花籽油为CLA的能力。

在脂酶水解甘油三酰键后，植物乳杆菌(L.plantarumLT2－6)洗涤细胞能将豆油(LA约占总脂肪酸含量的54%)转化为CLA［14］。董明等［15］利用植物乳杆菌(L.plantarum6026)催化盐生植物紫花苜蓿的种籽油(LA占总脂肪酸含量的30～35%)转化为CLA，取得了较好的效果。郭焱等［16］以德氏乳杆菌为出发菌株，经紫外线及硫酸二乙酯诱变后，获得一株能将红花籽油转化为CLA的菌株。

1.3 方式

目前，大部分CLA的微生物合成都采用生长细胞，即将活化后的菌株直接接种到培养液中，使微生物细胞边生长边转化合成 CLA［17－18］。此法操作简单，CLA合成所需周期通常较短。但存在不足之处——高浓度LA会抑制微生物细胞的生长，降低CLA 产率［19－20］。

静息细胞转化合成CLA专一性好，且能添加高浓度底物，从而获得CLA的高产量。但是，离心获得静息细胞需要在4℃条件下进行，操作步骤多，易导致LAI失活，限制了在工业上的应用。钮晓燕等［21］优化了植物乳杆菌ZS2058静息细胞产CLA条件，发现该菌具有很强的专一性∶c9，t11－CLA占总CLA的96.4%。Shigenobu Kishino等［22］从14株乳酸菌中筛选出的植物乳杆菌(L.plantarumAKU 1009a)静息细胞具有高产CLA能力;培养96h后，t9，c11－CLA含量占总CLA的98%。

Lin 等［23］破 碎 嗜 酸 乳 杆 菌 (L.acidophilusCCRC14079)以及费氏丙酸菌(P.freudenreichii ssp.ShermaniiCCRC11076)细胞，直接用粗酶液转化LA，产物以t10，c12－CLA、c11，t13－CLA和c9，t11－CLA三种异构体为主，表明LAI可直接用于合成CLA。随后，Lin［24］研究发现嗜酸乳杆菌保加利亚亚种(L.delbrueckii ssp.bulgaricusCCRC14009)静息细胞和粗酶液均可以转化LA为CLA。

2 微生物利用亚油酸的原因

LA对费氏丙酸菌、嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌等产CLA乳酸菌的生长有明显的抑制作用。胡国庆［19］等发现，在脱脂奶、豆奶、番茄三种培养基中，LA对植物乳杆菌ZS2058都有抑制作用。且随着LA浓度的增大，抑制作用越来越明显。张中义［25］也认为，低浓度LA对植物乳杆菌LT2－6的生长几乎没有影响。当LA增至0.1%时，细菌的生长以及CLA的合成均受到抑制。Lin等［20］采用嗜酸乳杆菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种以及德氏乳杆菌乳球菌亚种，LA添加量由1000mg/mL增至5000mg/mL时，CLA的产量反而降低，这与 Boyaval等［26］和 Jiang等［27］的报道一致。Li－Ming Wang［9］等发现底物浓度过高时，在 SLM、MRS、脱脂乳三种培养基中，费氏丙酸杆菌的生长均受到明显抑制。此外MRS是合成CLA的最佳培养基，主要是因为MRS中的吐温－80不仅可以促进细菌生长，还可以改变细胞膜通透性，缓解LA的抑制作用。

早在1954年，Nieman C［28］曾报道，游离脂肪酸易改变革兰氏阳性菌细胞膜的通透性，LA在细胞内被转化为CLA可能是细菌的一种自我解毒作用。Dawson等［29］认为，瘤胃菌为了消除LA对细胞的毒害作用，而将其转化为CLA。但是，LA浓度过高时，这一过程反而受到抑制，无法完全进行，细菌也因此而停止生长［19］。Kepler［30］等认为，LA可能会诱发乳酸菌对于多不饱和脂肪酸的解毒机制。一种途径就是通过氢化作用，将LA转变为十八碳一烯酸，而CLA是这一氢化过程的中间产物［11］。

3 CLA的合成机理

CLA的合成最初是在瘤胃中发现的，后来人们从动物瘤胃液、土壤、泡菜等原材料中分离出单一的具有CLA合成能力的微生物，并在体外模拟瘤胃液中CLA的合成或直接把分离的微生物加入MRS、脱脂乳等培养液中进行培养，优化其产CLA能力。由于分离获得的原始菌株CLA合成能力较低，人们通过紫外诱变、离子对注入、硫酸二乙酯、亚硝基胍等诱变处理，获得了CLA高产菌株。

CLA在瘤胃中的合成是一系列黏附在胃壁上或从食物中获得的瘤胃微生物协同作用的结果。CLA合成后，可进入细胞或通过分泌乳汁的形式排出体外。CLA的体外合成由单一微生物即可完成，因此，CLA的提取工艺也较简单。

3.1 CLA在瘤胃中的合成机理

瘤胃中存在多种CLA合成微生物。Uniya等［31］从牛的瘤胃中分离到几种乳酸菌，其中短乳杆菌(L.brevis)、绿色乳杆菌(L.viridescens)和乳酸杆菌(L.lactis)还可用于体外合成CLA。Choi等［32］认为，瘤胃中CLA的合成主要是瘤胃微生物的氢化还原作用。采用瘤胃微生物混合发酵得到的CLA以c9，t11－CLA和t10，c12－CLA为主，不同的喂料方式所产生的CLA异构体也不同;酸性和有氧气存在的条件，有利于合成t10，c12－CLA。Kepler［6］等发现，多不饱和脂肪酸的氢化作用是在瘤胃微生物的酶结合蛋白作用下完成的。不同的喂料方式、碳水化合物的种类等可以改变瘤胃微生物菌群构造，从而影响脂肪酸的代谢［32－33］。

食物中的脂类化合物进入瘤胃后，首先在瘤胃微生物分泌的脂酶作用下，水解甘油三酰、磷脂、糖脂等形式的脂质，形成游离脂肪酸。然后游离多不饱和脂肪酸再通过氢化作用进一步被还原。由于合成CLA的酶只作用于游离多不饱和脂肪酸，影响脂质水解程度的因素都会限制脂肪酸的转化。这一过程是瘤胃中许多定植微生物、从食物中获得的外源微生物及其酶的综合作用结果［34］。

1984年，Kemp等［35］根据代谢途径的不同，将瘤胃中氢化还原作用涉及的微生物分为两类∶第一类，将18碳的多不饱和脂肪酸逐步还原为十八碳一烯酸;第二类，将十八碳一烯酸进一步还原为硬脂酸。可见，CLA等十八碳二烯酸是这一氢化过程的中间产物。后来，人们又陆续发现一些瘤胃菌可以直接将18碳的多不饱和脂肪酸氢化为硬脂酸［36］。

图1 瘤胃内脂类化合物转化的关键步骤

游离脂肪酸(以LA为例)被释放出来后，瘤胃内的微生物通过异构化作用，将C12的顺式双键转变为C11的反式共轭双键，生成瘤胃酸。然后，在还原酶的作用下，瘤胃酸的C9双键被氢化为反式十八碳一烯酸。最后，C11双键也被氢化还原形成硬脂酸。硬脂酸的形成是限速步骤，因此，瘤胃中能检测到瘤胃酸和反式十八碳一烯酸的存在。瘤胃酸和反式十八碳一烯酸是游离脂肪酸氢化还原过程的中间产物［34，37－38］。

3.2 CLA的体外合成机理

根据底物的不同，从两方面阐述CLA的体外合成机理∶以LA为底物，包括以豆油等富含LA的油脂进行的CLA合成;以RA为底物，包括以富含RA的蓖麻油等的CLA合成。

3.2.1 亚油酸 2001年，Jun Ogawa等［12，39］对嗜酸乳杆菌(L.acidophilusAKU 1137)静息细胞转化LA为CLA的机理进行了研究，首次对微生物催化合成CLA原理进行了分析。实验中，Jun Ogawa等检测到10－羟基－顺－12－十八碳一烯酸、10－羟基－反－12－十八碳一烯酸和c9，t11－CLA、t9，t11－CLA的存在。且随着培养时间的延长，10－羟基－顺－12－十八碳一烯酸和10－羟基－反－12－十八碳一烯酸的含量逐渐降低，而c9，t11－CLA和t9，t11－CLA的含量逐渐增加。表明10－羟基－顺－12－十八碳一烯酸和10－羟基－反－12－十八碳一烯酸可能是LA转化为CLA过程的中间产物，CLA的合成并不是直接由非共轭双键异构化为共轭双键的。此外，Jun Ogawa的研究还发现，合成CLA的酶是诱导酶，必须在LA的存在下才能产生，但具体作用机制尚不清楚。

图2 微生物催化LA转化合成CLA步骤

但是，钮晓燕等［21］以植物乳杆菌 ZS2058转化LA时发现，随着培养时间的延长，伴随着大量羟基脂肪酸的产生，c9，t11－CLA含量逐渐减少;以CLA (c9，t11－CLA和t10，c12－CLA的混合样品)为底物进行反应时，c9，t11－CLA被转化为羟基脂肪酸。因此他们认为，c9，t11－CLA可能是该菌株合成羟基脂肪酸过程的中间产物。

3.2.2 蓖麻油酸 以蓖麻油酸为底物合成CLA可能存在两种机制∶C12上的羟基键断裂，脱去一分子水，形成C11双键，直接一步反应合成CLA;分为三步，首先是C12的羟基键断裂，脱水形成C12双键，即先合成LA;然后LA再通过两步异构化为CLA。研究发现，植物乳杆菌(L.plantarumAKU 1009a)在添加α－亚麻酸诱导培养后获得的静息细胞具有很强的转化RA为CLA的能力;以LA为底物时，CLA产量很低，表明第一种转化机制的存在。在产物中可以检测出LA和羟基脂肪酸，表明第二种转化机制也同样存在［12］。

蓖麻油必须通过脂酶作用，水解甘油三酰键使蓖麻油酸游离出来后，才能被乳酸菌利用。Akinori Ando等［40］研究了14种脂酶的作用效果，发现脂酶M“Amano”10的加入最有利于CLA的合成。同时，采用植物乳杆菌(L.plantarumJCM1551)静息细胞转化蓖麻油时，添加适量去垢剂Lubrol PX(聚氧化乙烯乙醚W－1)可以增加CLA产量。

目前，关于CLA合成机理的研究相对较少，人们主要关注的仍是如何提高微生物合成CLA的产量以及CLA的生理功能。微生物合成CLA是通过LAI的催化作用，但是，该酶是只作用于CLA合成中的某一步，还是整个过程，目前仍不清楚，需要更多的后续研究。

图3 微生物催化RA转化合成CLA步骤

4 展望

由于化学法合成CLA产物分离复杂、繁琐、合成条件苛刻，利用CLA高产菌株进行微生物合成不失为更好地选择。微生物法反应条件温和、设备要求低、产物分离简单。其中，以乳酸菌最为合适——大多数产CLA乳酸菌是人体益生菌，发酵成本低廉，发酵条件易控制，产物对人体安全，用来生产CLA可以直接应用于食品或精制成药品。但是，关于CLA的微生物合成机理研究得还不够透彻，存在诸多未解之处。

CLA的生理功能及健康意义已得到广泛认同。基于此，CLA已被应用于药品、保健品、功能食品、化妆品等领域。关于CLA应用于药品的临床报道较少，但CLA具有减肥、抗癌、抗动脉粥样硬化等作用已被证实，相信不久后CLA一定会是治疗这类疾病的良药。目前，市场上已出现多种CLA保健品，作为营养增强剂或减肥食品吸引了大量顾客。联合利华公司也曾推出过添加CLA的“岁月奇迹”系列护肤品。由此可见，CLA对人类健康意义重大，具有广阔的应用前景。

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Research progress in the mechanism of conjugated linoleic acid producing by microorganisms

ZHOU Qian，LIU Pei，LI Hai－xia，RUAN Hui，HE Guo－qing*
(School of Biosystem Engineering and Food Science，Zhejiang University，Hangzhou 310029，China)

Compared withthevariouschemicalmethods，conjugated linoleic acid(CLA)producing by microorganisms has predominant advantages.For example，it’s convenience to be cultured and easy to be isolated.This paper gave a review of current bio－production of CLA，comprehensively discusses the reason why linoleic acid(LA)can be converted by microorganisms and the mechanism of CLA’s bio－production.Plus，the last one was divided into two parts:how CLA was formed in rumen by the co－operation of several microorganisms，and the mechanism of CLA’s transformation by only one bacterium in vitro.

conjugated linoleic acid;linoleic acid;ricinoleic acid;mechanism of producing conjugated linoleic acid

TS201.1

A

1002－0306(2011)11－0468－05

2010－09－14 *通讯联系人

周倩(1986－)，女，硕士，研究方向:食品科学。

国家高技术研究发展计划(863计划)重点项目(2007AA100402)。