碱性蛋白酶及其在大豆肽制备中的应用

孙 倩，陈复生，丁长河，刘伯业

(河南工业大学粮油食品学院，河南郑州 450052)

碱性蛋白酶及其在大豆肽制备中的应用

孙 倩，陈复生*，丁长河，刘伯业

(河南工业大学粮油食品学院，河南郑州 450052)

碱性蛋白酶是一类重要的工业用酶，广泛应用于食品、医药、洗涤剂和皮革等领域。目前食品工业用酶主要来源于微生物，且实际生产中碱性蛋白酶的效果较好。从碱性蛋白酶的产生菌株、结构和性质、应用研究现状及其在大豆肽制备中的应用等方面进行了概述。

碱性蛋白酶，芽孢杆菌，大豆肽

碱性蛋白酶是在碱性条件下水解蛋白质肽键的酶类，是一类非常重要的工业用酶，最早发现于猪胰脏。碱性蛋白酶广泛存在于动、植物及微生物中。微生物蛋白酶均为胞外酶，不仅具有动植物蛋白酶所具有的全部特性，还有下游技术处理相对简单、价格低廉、来源广、菌体易于培养、产量高、高产菌株选育简单、快速、易于实现工业化生产等诸多优点［1］。1945年瑞士Dr.Jaag等在地衣芽孢杆菌中发现了微生物碱性蛋白酶［2］。1971年Horikoshi首先报导了嗜碱性微生物产碱性蛋白酶的研究［3］。近年来，微生物碱性蛋白酶一直为人们所关注，也是目前研究最为广泛的酶制剂之一。

1 碱性蛋白酶的产生菌种

食品工业用酶主要来源于微生物，微生物来源的蛋白酶按作用pH可分为三类，即碱性蛋白酶，中性蛋白酶及酸性蛋白酶，它们的作用最适pH分别为碱性，中性及酸性。这三类酶的活性中心有着明显的不同∶酸性蛋白酶含有两个羧基，能为DAN(重氮乙酸正亮氨酸甲酯)失活，不受鳌合剂、巯基试剂或丝氨酸蛋白酶抑制剂的影响;中性蛋白酶的活性中心含金属离子，常常是 Zn2+，可受到金属螯合剂EDTA的可逆抑制;碱性蛋白酶的活性中心为丝氨酸，能被二异丙基氟磷酸及苯甲基磺酸氯所抑制。用于实际生产中碱性蛋白酶水解效果较好。多数微生物碱性蛋白酶在pH7～11范围内有活性。在以酪蛋白为底物时最适pH以9.5±0.5为多，这种酶除水解肽键外，还具有水解酯键、酰胺键和转酯及转肽能力。碱性蛋白酶可水解植物、动物蛋白，Alcalase酶可作用于未端疏水氨基酸，使用这种酶可去除蛋白质水解时产生的苦味。来源于Bamyloliguefaciers的碱性蛋白酶可用于制备低变异源性的婴儿食品，还可用于制备果汁、饮料及治疗用人工配制的高蛋白膳食。

利用微生物生产蛋白酶有以下优点∶微生物生长快，适于大量快速培养;培养基成本低;可选用作为工业生产蛋白酶的微生物种类很多，同时又可用遗传操作手段将其改良;微生物生产的蛋白酶大多数是胞外酶，易于提取。由于这些优点，微生物成为生产碱性蛋白酶的首选材料和重要来源。产碱性蛋白酶的微生物在自然界分布广泛，主要分离此类微生物的环境有深海、盐碱湖、沙地等碱性环境。碱性蛋白酶主要产生菌为地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、米曲霉、栖土曲霉、灰色链霉菌、镰刀菌等(表1)。目前，商业中应用的碱性蛋白酶主要来源于芽孢杆菌(表2)，如丹麦酶制剂生产商NovoNordisk使用的生产菌株就包括地衣芽孢杆菌［Bacillus licheniformis］，缓慢芽孢杆菌［Bacillus lentus］，其它的碱性蛋白酶商业生产菌株还包括嗜碱性芽孢杆菌［Bacillus alcalophilus(Gist－Brocades，荷兰)］和枯草杆菌［Bacillus subtilis(Solvay Enzymes，德国)］等。一些革兰氏阴性菌及真菌等也产生碱性蛋白酶。国内主要有地衣芽孢杆菌2709、地衣芽孢杆菌C1213以及短小芽孢杆菌289和209［4］。

表1 常见产碱性蛋白酶微生物

表2 常见工业生产用碱性蛋白酶产生细菌菌株［5］

2 碱性蛋白酶的结构和性质

Keay按不同pH对蛋白酶作用于酪素的活性曲线，酯酶对蛋白酶活力的比值，免疫学分析中有无交叉反应，以及蛋白酶的氨基酸组成和序列差异，将其分为两种类型∶A型为Carlsberg型蛋白酶，B型为Novo型蛋白酶［6］。

蛋白酶是催化蛋白质水解成α－氨基酸的酶，不同蛋白酶有不同的活性中心基团，如丝氨酸、半胱氨酸、天门冬氨酸、Zn2+、Mn2+、Fe2+、Cu2+等。大多数微生物碱性蛋白酶的活性中心含有丝氨酸，属于丝氨酸蛋白酶，其最适作用pH为9～11。遇到作用于丝氨酸的试剂二异丙基氟磷酸(DFP)时失活，是碱性蛋白酶的重要特征。碱性蛋白酶对金属螯合剂EDTA、重金属和巯基试剂不敏感，但需要有金属离子Mn2+、Mg2+、Zn2+、Co2+、Fe2+等的启动。Ca2+对碱性蛋白酶有稳定作用［7］。碱性蛋白酶对底物有高度专一性［8］，只能水解蛋白质肽链，而不能水解淀粉、脂肪等其它物质，但是有可能水解多种蛋白质碱性蛋白酶作用位点，要求在水解点羧基侧具有芳香族或疏水性氨基酸，它比中性蛋白酶水解能力更大而且还具有一定的酯酶活力。

碱性蛋白酶具有信号肽。信号肽的存在是区分胞质蛋白和输出蛋白的唯一显著特征。研究发现，在解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)、枯草芽孢杆菌 (B.subtilis)、嗜 热 脂 肪 芽 孢 杆 菌(B.stearothermophilus)中分泌的中性蛋白酶与在解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliqufaciens)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、地衣芽孢杆菌(B.1icheniformis)中分泌的碱性蛋白酶信号肽段有同源程度很高的保守序列［9］。雷虹［10］等通过设计合适的引物，利用PCR技术从地衣芽孢杆菌2709菌株的染色体DNA中扩增了2709碱性蛋白酶的编码序列，分析发现地衣芽孢杆菌2709与NCIB6816的碱性蛋白酶的编码序列只有3%碱基组成差异，与已发表的两种 Substilisin Carlsberg型氨基酸序列长度一致，同源性为98%～99%。洪扬［11］等研究显示，2709的碱性蛋白酶信号肽与导肽无论氨基酸序列还是 DNA序列均与NCIB6816完全一致。可见，不同菌株产生的碱性蛋白酶其翻译加工切除信号肽和导肽的过程及调控机制基本一致。

3 碱性蛋白酶的研究与应用现状

3.1 国外研究与应用现状

蛋白酶是工业用酶中占据比例最大的酶类，大约占全世界每年总销售量的60%左右［12］。当前国外碱性蛋白酶高产菌株的选育主要是用基因工程技术和蛋白质工程手段进行工业微生物菌种的定向选育，目的性强，而且对酶结构的研究也比较深入。Pinar［13］等研究了 pH 对地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)生产碱性蛋白酶的影响。Murat［14］等通过固定化Teredinobacter turnirae细胞生产碱性蛋白酶。Laxman［15］等优化了Conidiobolus coronatus生产碱性蛋白酶的发酵条件，并研究了其扩大培养。Joo［16］等采用Bacillus clausiiI－52经液态发酵生产碱性蛋白酶并将其应用于洗涤剂工业。Ravichandradeng［17］等采用地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)NCIM－2042经液态发酵生产碱性蛋白酶，研究了发酵罐扩大培养过程中通气和搅拌对碱性蛋白酶产率的影响。

Anissa Haddar［18］等从Bacillus mojavensisA21中提取了两种碱性蛋白酶(BM1 and BM2)，通过SDSPAGE得到其分子量分别为29000u和15500u。两种酶最适pH分别为8.0～10.0和10.0。以酪蛋白作为底物，60℃条件下该酶活性最高。这两种酶对氧化剂和高pH都具有稳定性，可应用于洗涤剂行业。Qin Yao［19］等利用不同微生物菌种曲霉(Aspergillus sp.)、芽孢杆菌(Bacillus sp.)和酵母菌(yeast)分别在30℃条件下发酵黑豆，并分析测定了发酵过程中产生的抗氧化成分。研究表明发酵生产可提高黑豆生产中抗氧化物活性和自由基清除活性。Bassem Jaousdi［20］等从一株链霉菌菌株中提取和纯化了一种热稳定性碱性蛋白酶，该酶对有机溶剂具有高稳定性，其最适 pH为 11.5，最适温度为 75℃。Aihua Deng［21］等分离得到一株高酶活的碱性蛋白酶产生菌株芽孢杆菌B001(Bacillus sp.B001)，该菌株对表面活性剂具有高稳定性，最适反应pH为10.0，最适温度为60℃。随着研究的深入，极端碱性蛋白酶和高活力碱性蛋白酶工程菌的构建已经成为国外碱性蛋白酶的研究热点。

3.2 国内研究与应用现状

我国碱性蛋白酶研究较国外晚，对其研究技术主要有传统的诱变技术、基因工程、蛋白质工程等。目前我国洗涤行业中加酶洗涤剂占90%以上，且占有率有上升趋势，碱性蛋白酶的研究发展很快。张晶［22］等从富含蛋白质的土壤中筛选分离得到5株产碱性蛋白酶的菌株，经测定，25℃下各菌株酶活均超过200U/mL，最高达280U/mL。雷晓燕［23］等通过酪蛋白水解圈筛选模型筛选得到一株产碱性蛋白酶活力较强的细菌B1，并对其产酶条件进行了优化。李祖明等［24］采用短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)经紫外诱变育种和固态发酵生产碱性蛋白酶，酶产率可达15300U/g。孙同毅［25］等从土壤中分离出一株产碱性蛋白酶的嗜碱性芽孢杆菌并对其进行了表型分类和16S rDNA序列分析，确定了该菌株的分类学和系统发育学地位。成堃［26］等从土壤中分离出若干株产碱性蛋白酶的菌株，并对其进行了16S rRNA分子鉴定以及酶学性质的初步研究。褚忠志［27］等将短小芽孢杆菌Zkud20224液体的发酵液离心去菌体，用硫酸铵盐析得粗酶，透析除盐后进行Sephadex G275柱层析得到电泳纯碱性蛋白酶，用该法提纯的碱性蛋白酶比活力从粗酶液的 155.5U/mg提高到了954U/mg，回收率为27.6%。该酶水解酪蛋白的最适反应温度为50℃，最适作用pH为10，且该酶具有较高的热稳定性和耐碱性。

李祖明［28］等采用5L发酵罐研究短小芽孢杆菌2080产碱性蛋白酶的扩大培养。结果表明，在较优的扩大培养条件下，即空气流量2.5L/min、空气压力0.08MPa和搅拌速度500r/min，短小芽孢杆菌2080碱性蛋白酶的产率较摇瓶水平提高了28%，达到5.17×106U/mL，而发酵时间缩短为42h。孙同毅［29］等采用复合诱变(紫外照射、NTG、离子注入)方法，结合平板初筛与摇瓶复筛育高活力碱性蛋白酶产生菌株，获得了一株高产突变株HAPN－169，其酶活力为3.5×104U/mL，经中试发酵后酶活达4.2×104U/mL。肖静［30］等从土壤中筛选获得1株蛋白酶热稳定性较好的产碱性蛋白酶芽孢杆菌，该蛋白酶发酵16h达到产酶高峰。

李亚玲［31］等对一株产碱性蛋白酶假丝酵母菌的发酵条件进行了优化，研究各种碳源、氮源及无机盐对产酶的影响，并应用正交实验优化发酵培养基组成。那治国［32］等对3株地衣芽孢杆菌产碱性蛋白酶的去酰胺能力和肽键水解能力进行了比较，确定了1株去酰胺能力强而肽键水解能力弱的菌株，经过紫外诱变，筛选获得1株产碱性蛋白酶的去酰胺能力有显著提高的菌株 SDZ－61，去酰胺对达到了27.96%，比诱变前提高了56.6%，而肽键水解度基本没变。

4 碱性蛋白酶在大豆肽制备中的应用

国内外对大豆肽的制备研究主要集中在利用纯酶制剂进行直接酶解，但是由于商品酶制剂成本高昂，直接酶解法生产大豆肽代价巨大，限制了其在发展中国家的工业化生产。近年来，微生物发酵法因其原料成本低廉、工艺过程简便、条件温和、发酵效率高、多肽质量好等特点日益受到关注。微生物发酵法是利用发酵菌株所产生的蛋白酶，作用于大豆蛋白并将其水解为肽。选择合适的微生物在以豆粕为主的液体培养基上良好生长，微生物在生长代谢过程中大量分泌胞外蛋白酶和羧肽酶，在发酵过程中可以将大豆蛋白水解并脱除苦味根源的肽链末端疏水性氨基酸。

大豆肽的制备工艺中所用的微生物菌株主要集中在产蛋白酶的枯草杆菌1.398、放线菌166、栖土曲霉3.942和黑曲霉3350等。这些菌株具有很强的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶等活性，尤其蛋白酶有内切酶，酶解能力强，从内部水解大豆蛋白的肽链，易形成低分子易被吸收的大豆肽［33］。国外文献中报导了利用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilisGR－101(KCCM 10673P))和添加曲霉菌 oryzae GB－107(KCTC 10258BP)来发酵生产大豆肽。美国在74年成立Adle－Nissen领导专门研究水解蛋白课题机构，取得研究成果，Deltown Speciaties公司建成了年产5000t食用蛋白肽的工厂。日本也于80年代开始开展该方面的研究，日本不二制油公司致力于大豆肽的研究，从酶菌选育、水解工艺确定、水解产物脱苦技术及产品分离纯化等均取得较大进展，生产出3种大豆肽;日本Kodera Tomohiro等不添加任何脱苦吸附剂或遮盖剂，直接利用一种内切酶的作用，来切除疏水性末端氨基酸以除去苦味。雪印和森永等乳业公司均已成功地将大豆肽应用于食品工业。

我国近年来在此领域也开展了较多研究。黑龙江省的三乐源集团研制了“大豆蛋白活性肽”，武汉天天好生物制品有限公司在使用复合肽多级定向酶系统技术生产大豆肽方面处于国内领先水平，同时掌握了大豆蛋白肽的性能指针测定、检测方法以及功能评价等技术。2005年，由山东都庆股份有限公司、中国食品发酵工业研究院组建的注册资本5000万元的中食都庆(菏泽)生物技术有限公司，共同投资建设了5000t大豆多功能肽生产线。

我国许多高校等科研机构和人员也进行了这方面的研究开发。万琦［34］等筛选到一株能在发酵过程中产蛋白酶和外肽酶的枯草芽孢杆菌，利用所产蛋白酶的作用将大豆蛋白水解成短肽，利用所产羧肽酶的作用将短肽末端的疏水性氨基酸切除，实现了酶解和脱苦一步完成的大豆肽发酵生产。刘唤明［35］等用高产蛋白酶的枯草芽孢杆菌进行发酵法生产大豆肽的研究，优化了发酵法制备大豆多肽的生产工艺。刘明［36］等以透明圈法、酶活力方法为指标从12株枯草芽孢杆菌中筛选出4株产酶高、活力强的菌株，并用总抗氧化性为指标进行复筛得到适宜发酵生产大豆抗氧化活性肽的菌种。余勃［37］等利用30L发酵罐发酵豆粕，对微生物法生产大豆多肽的工艺进行了研究。酶活分析表明发酵菌株Bacillus subtilisSHZ3能同时分泌蛋白酶和羧肽酶，分别水解大豆蛋白和肽链末端的疏水性氨基酸，使大豆蛋白的水解和多肽的脱苦在发酵过程中一步完成，生产出不苦的大豆多肽。陈宏军［38］通过发酵实验对3株芽孢杆菌进行筛选，得到一株发酵豆粕粉效率较高的地衣芽孢杆菌，确定了其发酵条件。经过优化后，发酵液的水解度达到15.9%，比优化前提高了1.92倍，豆粕蛋白水解度也有明显提高。陈名洪［39］等以脱脂豆粕为原料，具有产蛋白酶能力的菌株CHD21为生产菌株进行发酵。菌株所产蛋白酶作用于豆粕粉中的大豆蛋白将其水解为大豆多肽。实验以水解度作为指标，对菌株发酵降解豆粕的条件进行了优化。

5 展望

目前，我国微生物碱性蛋白酶的研究已经达到分子水平，高产菌种的选育由传统单纯的使用诱变手段逐步过渡到应用基因工程技术。随着基因工程的快速发展，越来越多的高温蛋白酶基因被克隆，碱性蛋白酶结构和功能的关系更加清楚，对酶进行的相关改造将有利于碱性蛋白酶在更多行业发挥重要作用。相信随着生物技术基础研究的深入和应用技术手段的完善，碱性蛋白酶的研究和应用范围必将进一步深入和扩大，具有极大的发展前景。

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Alkaline protease and its application in soybean peptide preparation

SUN Qian，CHEN Fu－sheng*，DING Chang－he，LIU Bo－ye
(School of Food Science and Technology，Henan University of Technology，Zhengzhou 450052，China)

Alkaline protease，which is an important kind of industrial enzyme，has been widely applied in food industry，medical treatment，detergent industry，leather producing and other fields.Nowadays，the enzymes for food industry mainly come from microorganism，and the effect of alkaline protease is much better.This article summarizes the producing strains，structure and properties，current use and research status of alkaline protease.Its application in soybean peptide preparation has also been mentioned.

alkaline protease;bacillus;soybean peptide

TS201.2+5

A

1002－0306(2011)11－0487－05

2010－12－02 *通讯联系人

孙倩(1986－)，女，硕士研究生，研究方向:食品资源开发与利用。

国家自然基金项目(20976037);河南工业大学博士基金项目(2010BS014);2010年河南省高新技术产业化专项基金。