新型罗丹明B衍生物增色铜离子检测性能

黎俊波，曾 阳，陈方胜，高 杨，胡启辉，潘志权

（绿色化工过程教育部重点实验室，武汉工程大学化工与制药学院，湖北武汉430074）

新型罗丹明B衍生物增色铜离子检测性能

黎俊波，曾 阳，陈方胜，高 杨，胡启辉，潘志权＊

（绿色化工过程教育部重点实验室，武汉工程大学化工与制药学院，湖北武汉430074）

设计、合成一种新的罗丹明与香豆素连接的功能染料，7－二乙胺基香豆素－3－罗丹明B酰肼西夫碱（RHC），在乙腈／水（4∶1，v／v，p H＝7.0）溶液中，该探针本身为黄色，加入铜离子后很快变为紫红色，而其它金属离子的加入没有明显的颜色变化.该探针与铜离子的结合比例为1∶2，探针能选择性的检测铜离子，可用于环境中铜离子的快速实时检测.

罗丹明；香豆素；铜离子；离子检测

0 引 言

20世纪以来科学技术迅猛发展，促进了经济的发展，提高了人民的生活水平，与此同时，人类却付出了惨重的代价.由于人类对重金属的开采、冶炼、加工及商业制造活动日益增多，造成不少重金属如铅、汞、镉、钴等进入大气、水、土壤中，引起严重的环境污染.随着环境保护意识的提高，对环境重金属离子的检测逐步受到人们的关注［1－3］.在过去，许多分析手段，如原子吸收光谱、电感耦合等离子体质谱、连续流冷蒸汽原子荧光光谱、电感耦合等离子体原子发射光谱、电化学方法等都被应用于检测环境中的重金属离子［4－8］.此类方法缺点为仪器价格过高，样品处理过于复杂.而有机小分子探针具有分子结构易修饰，合成简单，成本低廉，检测过程操作简单等优点，近年来，已经报道大量的有机小分子探针用于环境中重金属离子的检测［9－11］.

铜作为人们生产、生活中必不可少的一种重金属材料，同样对环境造成极大的污染.然而铜元素也是动植物体内所必需的微量重金属元素之一，其参与了大约二十多种酶的在机体内的作用，如过氧化物歧化酶、酪氨酸酶、多巴胺B－羟化酶、赖氨酰氧化酶、细胞色素氧化酶和铜蓝蛋白等［12］.但是，当机体内的铜离子浓度过高时，细胞便会受损或坏死，从而导致脏器功能损伤.由此看来寻求快速有效的铜离子检测方法不仅对环境合理保护而且对生物体正常运转都意义重大.由于二价铜离子是d9结构的顺磁性离子，对荧光具有极强的淬灭性，许多报道的铜离子荧光探针是荧光淬灭型的，因此设计荧光增强型或者比色型Cu2＋探针具有重要的意义.

罗丹明B衍生物作为一种理想的金属离子探针发色团，具有良好的水溶性、大的摩尔吸光系数、可见光区的吸收及荧光等优点［13－15］.同时，罗丹明B衍生物在某些外界因素刺激下（如重金属离子的加入）能由闭环内酰胺状态转变为开环酰胺状态，这种结构的变化便导致颜色的改变以及荧光的产生，基于此独有原理制备的罗丹明B衍生物对重金属离子的检测已成为研究的热点［16－17］.而同样作为基础荧光传感器的香豆素类化合物是一类结构较为特殊的肉桂酸内酯，具有较好的荧光性能，近年来也逐渐成为一个新的研究热点［18－19］.另外，香豆素的羰基氧原子可以参与对金属离子的配位［20－21］，因此可以高效地对其颜色或荧光进行调整.在本研究中，笔者将罗丹明、香豆素这两类荧光团结合为一种西弗碱，得到了一种新的罗丹明香豆素衍生物（RHC）染料.该探针（M＝1×10－5mol／L）在CH3CN／H2O（v／v，4∶1）溶液（p H＝7.0）中具有良好的溶解性，溶液为黄色，当加入10 eq的铜离子后，其溶液立刻变为紫红色，并在2 min之内达到平衡.其它金属离子，特别是易干扰铜离子的Fe3＋、Pb2＋对其检测无明显干扰，该探针能选择性的对铜离子进行检测.

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

紫外光谱仪（日本岛津公司1601型）；精密p H计（Model p HS－3C型）；核磁共振仪（德国Bruker公司，400和600 MHz）；Biflex III质谱仪（德国Bruker公司）.

Cu（ClO4）2·6H2O购于Aldrich公司，其它化学试剂（除乙腈为色谱纯外）均为国产分析纯试剂，且所有溶剂均经过常规纯化过程处理，水为二次蒸馏水.金属离子Li＋、K＋、Na＋、Ca2＋、Fe2＋、Fe3＋、Ag＋、Pb2＋、Ni2＋、Mg2＋、Cd2＋、Al3＋等溶液均为其水合硝酸盐配制而成，Cu2＋、Mn2＋、Ba2＋、Zn2＋溶液均为其水合高氯酸盐配制而成.

1.2 合成与表征

罗丹明酰肼（2）的合成方法参照文献［17］，产率77%.7－二乙氨基香豆素－3－醛参照文献方法由两步反应制得，总收率56.1%［22］.其合成路线如图1所示.

图1 罗丹明香豆素衍生物RHC的合成路线图Fig.1 Synthetic process of Rhodamine Coumarin derivatives RHC

7－二乙氨基香豆素－3－醛（1）的合成：称取1.93 g 4－二乙氨基水杨醛于250 mL圆底烧瓶，加入30 mL绝对无水乙醇溶解，再加入3.2 g丙二酸二乙酯以及1 m L吡啶，回流反应6 h，减压蒸馏除去溶剂.加入20 mL浓HCl和20 m L冰醋酸使反应水解.倒入100 m L冰水中，逐滴加入质量分数40%的NaOH溶液将其p H调至5，析出浅黄色沉淀.搅拌30 min，过滤，用大量水洗涤滤饼，真空干燥，用甲苯重结晶得纯产物7－二乙氨基香豆素.滴加10 mL无水DMF使该产物溶解.在20～50℃、氮气保护条件下将2 mL无水DMF逐滴加入到2 mL POCl3中，搅拌30 min得红色溶液.将该溶液加入到7－二乙氨基香豆素溶液中，得到深红色的悬浮物，在60℃下搅拌12 h，再倒入冰水中.加入质量分数20%的NaOH溶液调节p H至中性，有大量沉淀析出，过滤，滤饼用大量水洗涤、真空干燥，经绝对无水乙醇重结晶得到目标产物，产率56.1%.

罗丹明B酰肼（2）的合成：称取5 g罗丹明B于250 m L圆底烧瓶，加入150 m L无水甲醇溶解，再加入质量分数85%的水合肼6.5 m L，回流反应24 h.反应体系倒入800 m L蒸馏水中，产生大量沉淀，过滤，用大量水洗涤滤饼，真空干燥，得罗丹明酰肼3.98 g，产率77%.

RHC的合成：在100 m L圆底烧瓶中加入1.5 g罗丹明酰肼、0.72 g香豆素甲醛，并加入30 m L绝对无水甲醇溶解，加热回流24 h后，冷却、过滤，用适量无水甲醇洗涤所得滤饼，真空干燥，经无水甲醇重结晶得目标产物1.29 g，产率58.1%.

RHC1H NMR表征（氘代氯仿）δ（×10－6）：1.61（m，18H），3.31（q，8H），6.47（s，2H），6.52（d，3H），7.04（d，1H），7.27（s，1H），7.45（m，2 H），7.99（d，1H），8.19（s，1 H），8.36（s，1 H）.

RHC13C NMR表征（氘代氯仿）δ（×10－6）：12.5，44.5，65.7，96.8，98.1，105.5，107.9，109.8，114.6，123.4，127.7，128.1，128.5，130.0，133.3，138.1，148.8，150.9，152.3，153.0，156.7，161.2，164.9.

RHC质谱表征：m／z 684.4（［M］＋），计算值684.3.

1.3 实验方法

1.3.1 RHC标准液的配制 准确称取RHC68.4 mg于100 m L的容量瓶中，配制成10－4mol／L的乙腈溶液，取10 m L 10－4mol／L的RHC溶液，70 m L的色谱纯乙腈，20 m L的二次蒸馏水于100 m L的容量瓶中，配制RHC标准液浓度1×10－5mol／L.

1.3.2 测量方法 准确移取3.00 m L新配制的RHC标准液于1 cm紫外池中，测定其紫外－可见光谱.再分别加入30μL 10－2mol／L各种金属离子的溶液，摇匀，静置2 min，测定其紫外－可见光谱.

2 结果与讨论

2.1 检测机理研究

2.1.1 结合比例与结合常数测定 利用Job′s Plot方法配制了一系列RHC与铜离子总浓度为1×10－5mol／L，浓度比分别为10∶0、9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5、4∶6、3∶7、2∶8、1∶9、0∶10的溶液，分别测定其紫外－可见吸收光谱，在最大吸收波长554 nm处取值.如图2所示，当RHC染料浓度与铜离子浓度之比为1∶2时吸光度达到最大值，表明Cu2＋与RHC染料的结合比为2∶1.

图2 在RHC与铜离子总浓度为1×10－5 mol／L的CH 3 CN／水（4∶1，v／v）混合溶剂中随铜离子比例的变化溶液在554 nm处吸收值的变化图Fig.2 Absorption at 554 nm of RHC and Cu2＋in CH 3 CN－water（4∶1，v／v）with a total concentration of［RHC］＋［Cu2＋］＝10μM indicating a 2∶1 metal－ligand ratio of the complexation between RHC and Cu2＋

利用非线性拟合方法得到其结合常数，拟合公式如下：

其中A0表示溶液中只存在染料RHC时的吸光度，A表示加入一定量的Cu2＋后的吸光度，Amax表示加入过量的Cu2＋后的吸光度，K是结合常数，［Cu2＋］0是加入铜离子的浓度，如图3所示的滴定曲线，随着溶液中铜离子浓度增大，染料在554 nm处的吸收值不断上升，依据滴定曲线的数据得到1／（A－A0）对1／［Cu2＋］02成线性关系（图4），线性拟合R＝0.988 42，表明染料RHC与Cu2＋以1∶2的比例方式结合，染料与铜离子的结合常数K＝2.52×108（mol／L）－2.

图3 滴加Cu2＋至RHC中时紫外－吸收光谱变化图Fig.3 UV－vis titration of RHC（1×10－5 mol／L）with Cu2＋ion in CH3 CN／H 2 O with increasing of Cu2＋concentration

图4 Benesi－Hildebrand线性分析曲线Fig.4 Benesi－Hildebrand linear analysis plot of RHC at different Cu2＋concentration

2.1.2 结合机理探讨 罗丹明羰基上的氧、腙上的氮原子以及香豆素羰基上的氧原子能作为重金属离子的配位点.图5所示为RHC及RHC＋Cu2＋的红外光谱图，加入了Cu2＋后，RHC分子中C＝O和C＝N红外吸收峰由原先的1 716 cm－1和1 615 cm－1处蓝移至1 588 cm－1，表明羰基的氧原子以及腙上的氮原子与Cu2＋进行了配位.染料RHC与Cu2＋可能的结合方式如图6所示，染料与Cu2＋结合后，螺环碳打开，形成氧杂蒽环结构，此时所形成的这个共轭大π键使得该染料在554 nm处紫外－可见吸收明显增强.

图5 RHC及RHC＋Cu2＋的红外光谱图Fig.5 IR spectra of RHC（a）and Cu2＋－binding complexation（b）

图6 RHC与Cu2＋离子的可能结合方式图Fig.6 Possible binding mechanism of Cu2＋and RHC

2.1.3 可逆性质研究 其测量方法为：在1 cm的比色皿中加入3 m L，1×10－5mol／L的RHC溶液，测定紫外－可见光光谱，再向其中加入30μL，1×10－2mol／L的Cu2＋（10 eq）溶液，摇匀、静置2 min，测定其紫外－可见光光谱.之后继续加入足量配制好的EDTA溶液，摇匀，静置2 min，测定其紫外－可见光光谱.由图7可见，RHC染料溶液本身呈黄色透明，在加入Cu2＋后溶液颜色变为紫红色，于554 nm处有强吸收，表明其对Cu2＋有良好响应.再加入足量EDTA后溶液再次变回黄色透明，在554 nm处无明显吸收，表明EDTA将Cu2＋全部结合，染料重新游离出来，证明该染料与Cu2＋的结合是一个可逆过程.

图7 Cu2＋与染料可逆性结合的紫外－可见光光谱图Fig.7 Absorption spectra of RHC in the absence and presence of Cu2＋and EDTA

2.2 p H值的影响

在CH3CN／H2O（v／v，4∶1）的混合溶剂中，测定了在不同p H值条件下染料RHC在554 nm处吸收值的变化.在p H值为3～11之间，RHC溶液呈黄色（吸收值A小于0.01），加入十倍当量Cu2＋后溶液立即变为紫红色（吸收值A＝0.71左右），如图8所示.而在p H小于3的条件下（在554 nm处吸收值小于0.01），往RHC溶液加入铜离子溶液颜色没有明显的变化，其原因可能为强酸性条件下西夫碱的碳氮双键断裂，游离出的氨基与强酸作用生成铵盐，失去了与铜离子的结合能力，因此在铜离子的作用下螺环碳不能打开，不能形成氧杂蒽环结构.在p H大于11的条件下，RHC溶液为黄色，加入铜离子后颜色也没有大的变化，原因可能为强碱条件下Cu2＋与OH－的结合能力大于其与RHC的，导致Cu2＋基本上不与配体结合而无颜色变化.因此，该探针能在p H值为4～11之间选择性检测铜离子，考虑到该探针在生物体系的可能应用，笔者选用生物体系的p H值环境（p H＝7.0）作为探针分子的性质测试p H值.

图8 RHC＋Cu2＋在不同的p H值条件下于554 nm处的吸收值Fig.8 Variation of UV－vis absorbance value at 554 nm of RHC（10μmol／L）in aqueous solution（CH 3 CN／H 2 O＝4∶1）with Cu2＋（100μmol／L）as a function of p H

2.3 离子选择性探讨

RHC的CH3CN／水（4∶1，v／v）溶液（1× 10－5mol／L）中加入十倍当量的不同金属离子后的紫外－吸收光谱图变化如图9所示.456 nm处吸收峰为香豆素骨架的特征吸收峰，加入铜离子后，RHC在554 nm处吸收值增加至0.71，同时香豆素特征峰红移至488 nm，溶液由淡黄色变为紫红色.其它离子的加入除铁（Ⅲ）离子有一定的吸收外（最大吸收峰强度为加入铜离子后的1／3.3左右，其最大吸收峰红移至559 nm），都基本没有影响.这主要是因为加入铜离子后，罗丹明酰胺被打开，生成开环结构［23－24］，使其554 nm处吸收大幅增加.紫外测试结果表明，RHC具有较好的离子检测的选择性.

图9 在RHC的乙腈／水＝4∶1溶液（1×10－5 mol／L）中加入各种金属离子（1×10－4 mol／L）的紫外－吸收光谱图Fig.9 UV－vis spectra of RHC（1×10－5 M）in CH3 CN／H2 O（4∶1，p H＝7.0）with 10 eq different metal ions

3 结 语

设计、合成了一种新型的罗丹明－香豆素类衍生物探针RHC，该染料在含80%乙腈的水溶液中能选择性的检测Cu2＋，其它的离子特别是极易干扰的Fe3＋以及Pb2＋对铜离子的检测无明显影响.该探针与Cu2＋为可逆性结合过程，且体系中Cu2＋浓度发生变化时，可通过颜色上变化直观反映出来，从而实现对Cu2＋的实时快速检测.

［1］ Alizadeh K，Parooi R，Hashemi P，et al.A new Schiff＇s base ligand immobilized agarose membrane optical sensor for selective monitoring of mercury ion［J］.Journal of Hazardous Materials，2011，186：1794－1800.

［2］ Tangang L J，Li F F，Liu M H，et al.Single sensor for two metal ions：Colorimetric recognition of Cu2＋and fluorescent recognition of Hg2＋［J］.Spectrochimica Acta Part A，2011，78：1168－1172.

［3］ Masrournia M，Zamani H A，Mirrashid H A，et al.Di－tert－butylazodicarboxylate based PVC membrane sensor for Fe（III）ion measurement in pharmaceutical formulation［J］.Materials Science and Engineering C，2011，31：574－578.

［4］ Tseng C M，Diego A D，Martin F M，et al.Rapid Determination of Inorganic Mercury and Methylmercury in Biological Reference Materials by Hydride Generation，Cryofocusing，Atomic Absorption Spectrometry After Open Focused Microwave－assisted Alkaline Digestion［J］.J Anal Atom Spectrom，1997，12：743－750.

［5］ Li Y F，Chen C Y，Li B.Elimination efficiency of different reagents for the memory effect of mercury using ICP－MS［J］.J Anal Atom Spectrom，2006，21： 94－96.

［6］ Chen Y W，Tong J，D′Ulivo A，et al.Determination of mercury by continuous flow cold vapor atomic fluorescence spectrometry using micromolar concentration of sodium tetrahydroborate as reductant solution［J］.Analyst，2002，127：1541－1546.

［7］ Anthemidis A N，Zachariadis G A，Michos C E，et al.

Time－based on－line preconcentration cold vapour generation procedure for ultra－trace mercury determination with inductively coupled plasma atomic emission spectrometry［J］.Anal Bioanal Chem，2004，379：764－769.

［8］ Yantasee W，Lin Y H，Zemanian T S，et al.Voltammetric detection of lead（II）and mercury（II）using a carbon paste electrode modified with thiol self－assembled monolayer on mesoporous silica（SAMMS）［J］.Analyst，2003，128：467－472.

［9］ Dujols V，Ford F，Czarnik A W.A Long－Wavelength Fluorescent Chemodosimeter Selective for Cu（II）Ion in Water［J］.J Am Chem Soc，1997，119：7386－7387.

［10］ Ciesienski K L，Hyman L M，Derisavifard S，et al.Toward the Detection of Cellular Copper（II）by a Light－Activated Fluorescence Increase［J］.Inorg Chem，2010，49：6808－6810.

［11］ 黎俊波，李楠楠，余响林，等.高选择性铁离子荧光探针的合成及性质研究［J］.武汉工程大学学报，2010，32（5）：11－14.

［12］ Malvankar P L，Shinde V M.Ion－pair Extraction and Determination of Copper（Ⅱ）and Zinc（Ⅱ）in Environmental and Pharmaceutical Samples［J］.Analyst，1991，116：1081－1084.

［13］ Wang H G，Li Y P，Xu S F，et al.Rhodamine－based highly sensitive colorimetric off－on fluorescent chemosensor for Hg2＋in aqueous solution and for live cell imaging［J］.Org Biomol Chem，2011，9：2850－2855.

［14］ Chen X Q，Jou M J，Lee H Y，et al.New fluorescent and colorimetric chemosensors bearing rhodamine and binaphthyl groups for the detection of Cu2＋［J］.Sensors and Actuators B，2009，137：597－602.

［15］ Amrita C，Mithun S，Nayoun W，et al.Selective Fluorogenic and Chromogenic Probe for Detection of Silver Ions and Silver Nanoparticles in Aqueous Media［J］.J Am Chem Soc，2009，131：2040－2041.

［16］ Huang K W，Yang H，Zhou Z G，et al.Multisignal Chemosensor for Cr3＋and Its Application in Bioimaging［J］.Org Lett，2008，10（12）：2557－2560.

［17］ Yu F B，Zhang W S，Li P，et al.Cu2＋－selective naked－eye and fluorescent probe：its crystal structure and application in bioimaging［J］.Analyst，2009，134：1826－1833.

［18］ Zhou Y，Liu K，Li J Y，et al.Visualization of Nitroxyl in Living Cells by a Chelated Copper（Ⅱ）Coumarin Complex［J］.Org Lett，2011，13：1290－1293.

［19］ He G J，Zhao X W，Zhang X L，et al.A Bright and Specific Turn－on Fluorescence Sensor for Imaging Copper（Ⅱ）in Living Cells［J］.New Journal of Chemistry，2010，34：1055－1058.

［20］ Jung H S，Kwon P S，Lee J W，et al.Coumarin－Derived Cu2＋－Selective Fluorescence Sensor：Synthesis，Mechanisms，and Applications in Living Cells［J］.J Am Chem Soc，2009，131：2008－2012.

［21］ Sheng R，Wang P F，Gao Y H，et al.Colorimetric Test Kit for Cu2＋Detection［J］.Org Lett，2008，10： 5015－5018.

［22］ Wu J，Liu W，Zhuang X，et al.Fluorescence Turn On of Coumarin Derivatives by Metal Cations：A New Signaling Mechanism Based on C═ N Isomerization［J］.Org Lett，2007，9：33－36.

［23］ Jun M E，Ahn K H.Fluorogenic and Chromogenic Detection of Palladium Species through a Catalytic Conversion of a Rhodamine B Derivative［J］.Org Lett，2010，12：2790－2793.

［24］ Zheng H，Shang G Q，Yang S Y，et al.Fluorogenic and Chromogenic Rhodamine Spirolactam Based Probe for Nitric Oxide by Spiro Ring Opening Reaction［J］.Org Lett，2008，10：2357－2360.

Properties of novel Rhodamine B derivative colorimetric sensor for copper ion

LI Jun－bo，ZENG Yang，CHEN Fang－sheng，GAO Yang，HU Qi－hui，PAN Zhi－quan
（Key Laboratory for Green Chemical Process of Ministry of Education，School of Chemical Engineering ＆Pharmacy，Wuhan Institute of Technology，Wuhan 430074，China）

A novel functional dye of Rhodamine linked with Coumarin derivative，Rhodamine B hydrazide 7－diethylamino－3－formoxyl－Coumarin schiff－base（RHC）were designed and synthesized.The solution of RHC（CH3CN／H2O＝4∶1，v／v，p H＝7.0）turned from yellow to amaranth when 10 eq Cu2＋was added.The selectivity and sensitivity of RHC were very high.RHC formed 1∶2 complex with Cu2＋which can be used in the quick detection of Cu2＋in environment.

Rhodamine B；coumarin；copper ion；ions detection

张 瑞

O626.31

A

10.3969／j.issn.1674－2869.2011.11.001

1674－2869（2011）11－0001－06

2011－09－19

国家自然科学基金（20901063）；绿色化工过程教育部重点实验室开放基金（GCP200905）资助；武汉工程大学第六届校长基金资助项目

黎俊波（1979－），男，湖北监利人，副教授，博士.研究方向：超分子化学.

＊通信联系人：潘志权，教授，博士，博士研究生导师.研究方向：无机化学.