石斛兰SIZ1基因的克隆及序列分析

王亚琴， 钟开新， 阳成伟， 梁 山

(1.华南理工大学生物科学与工程学院，广东广州 510006；2.华南师范大学生命科学学院,广东省植物发育生物工程重点实验室，广东广州 510631)

石斛兰SIZ1基因的克隆及序列分析

王亚琴1,2*， 钟开新1， 阳成伟2， 梁 山2

(1.华南理工大学生物科学与工程学院，广东广州 510006；2.华南师范大学生命科学学院,广东省植物发育生物工程重点实验室，广东广州 510631)

首次从石斛兰中克隆到1个类SIZ1基因，命名为DenSIZ1, 运用生物信息学软件分析与预测其蛋白的理化性质、结构组成、二级结构、功能结构域与亚细胞定位．结果表明，DenSIZ1可能属于PIAS家族SUMO E3连接酶，包括3个重要的功能结构域SAP、PHD和zf-MIZ，且该蛋白可能定位于细胞核中，与PIAS家族有较高的同源性．

石斛兰； SUMO E3连接酶； 基因克隆； 序列分析

植物的SUMO化途径参与有机和无机胁迫反应、植物开花及生长发育等生理过程[1]．在拟南芥中存在着PIAS保守序列的SUMO E3酶AtSIZ1，其促进转录因子PHR1和ICE1的SUMO化修饰，其中PHR1参与调节磷酸饥饿信号途径，ICE1参与调节低温胁迫反应[2-3]．而且，AtSIZ1是磷饥饿应激反应的关键调节者，也是SA途径和受PAD4(肽酰基精氨酸脱亚氨酶-4)调节的R基因信号传递途径的关键酶，这2条途径与拟南芥的初级免疫相关；此外，AtSIZ1还参与植物生长调节、干旱和低温耐受应激响应．本研究首次从石斛兰基因组中克隆到1个与拟南芥SIZ1氨基酸序列高度同源的类SIZ1基因，命名为DenSIZ1(DendrobiumSIZ1)．运用生物信息学软件，对其蛋白的理化性质、结构组成、二级结构、功能结构域与亚细胞定位等进行了分析与预测,同时构建了过表达载体转化Atsiz1突变体,为研究DenSIZ1基因的功能，探讨该基因与植物生长和各种非生物胁迫应激反应之间的机制奠定基础．

1 材料与方法

1.1实验材料

石斛兰(Dendrobium)cDNA由华南师范大学生命科学学院石斛兰课题组惠赠，以20～30 d冷处理植株提取总RNA反转录的cDNA为供试材料．

1.2DenSIZ1基因引物设计

从石斛兰cDNA文库中筛选到与AtSIZ1的5′端核酸序列和氨基酸序列同源性较高的序列.根据筛选到的核酸序列用Primer Premier5设计3′RACE中间特异引物：DenSIZ1-GSP1: 5′-GCAAAGCAAGGAAAGAAGCGGG-3′;DenSIZ1-GSP2: 5′-TCCAGAGGAAAGGGATGAAACCAG-3′;DenSIZ1-GSP3: 5′-GTTCGTTGCTTTTGTGGGGTTAC-3′, 根据在基因PolyA上连接的一段特异性序列设计的3′CDSⅢ与3′RACE中间特异引物进行扩增，测序结果与5′端序列拼接获得初始DenSIZ1 cDNA序列．通过NCBI-ORF Finder查找开放阅读框，与AtSIZ1序列比对确定DenSIZ1编码区．其中3′CDSⅢ：5′-ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG-d(T)30VN-3′，DenSIZ1基因特异引物：DenSIZ1-F: 5′-GGTACCCATGGATTTGGCCATCAGTTG-3′；DenSIZ1-R: 5′-GCCCTCACTAGTAGATAAGACTTGACCATTGTC-3′．

1.3DenSIZ1基因的克隆与测序

以石斛兰cDNA为模板，PCR反应体系包括：Premix LA Taq 25 μL, cDNA模板1 μL，正向和反向引物各1 μL(20 μmol/L),加水至50 μL，混匀离心．3′RACE法扩增反应条件为：94 ℃预变性4 min; 94 ℃变性30 s, 58 ℃退火30 s, 72 ℃延伸3 min，30个循环；72 ℃延伸10 min．DenSIZ1全长基因扩增反应条件为：94 ℃预变性4 min; 94 ℃变性30 s, 62 ℃退火30 s, 72 ℃延伸3 min，30个循环；72 ℃延伸10 min．通过中间特异引物与3′RACE特异引物进行PCR扩增，在确定目标产物序列的前提下，再设计DenSIZ1基因特异引物进行PCR扩增获得DenSIZ1全长基因．

PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离和DNA胶回收试剂盒纯化，克隆到pMD20-T载体中，转化大肠杆菌DH5α，经菌落PCR检测及质粒酶切鉴定，送上海英俊生物技术有限公司测序．

1.4DenSIZ1蛋白的结构与功能分析

DenSIZ1蛋白结构分析通过ExPASy在线ScanProsite完成；利用在线工具TMHMM分析蛋白质跨膜结构域；蛋白质翻译后修饰的糖基化位点和磷酸化位点分析采用DictyOGlyc在线软件和NetPhos2.0 Server分析；利用GOR在线工具完成DenSIZ1蛋白的二级结构预测；通过ExPASy提供分析工具ProtScale分析蛋白的亲疏水性；利用Pfam进行DenSIZ1的结构域功能分析；通过WOLF PSORT进行DenSIZ1蛋白亚细胞定位预测．

1.5DenSIZ1分子进化树的构建

从GeneBank数据库中收集到29条SUMO E3 ligase 蛋白序列，其中3条来自植物，其余来自动物．利用Lasegene-MegAlign软件的ClustalW2法进行序列比对，并构建DenSIZ1的分子进化树．

2 结果与分析

2.1DenSIZ1基因的克隆及鉴定

以石斛兰cDNA为模板，运用3′RACE法, 经中间特异引物DenSIZ1-GSP1、DenSIZ1-GSP2、Den-SIZ1-GSP3与3′CDSⅢ进行PCR扩增，最终确定目的条带为2 200 bp 左右DNA片段(图1)．PCR产物纯化后, 连接到pMD20-T载体，挑取阳性克隆进行PCR鉴定，测序后获得DenSIZ1 3′端序列，与已知5′端序列拼接形成DenSIZ1全长序列．

根据上述已知的DenSIZ1全长序列，设计Den-SIZ1全长特异引物DenSIZ1-F和DenSIZ1-R，克隆2.6 kb左右的DNA片段(图2)．连接pMD20-T载体，转化E.coliDH5α，取6个平行阳性克隆子的测序，分析后获得含有一个完整编码区的基因序列，命名DenSIZ1．

2.2DenSIZ1核苷酸、氨基酸序列组成和理化性质分析

通过NCBI网站的BLAST工具比较分析DenSIZ1的CDS序列，该片段与其他植物的SUMO ligase基因家族同源性较高．如与蓖麻Ricinuscommunis的SUMO ligase、水稻OryzasativaJaponicaGroup的Os05go125000、拟南芥的AtSIZ1的序列相似性都高达99%．DenSIZ1 cDNA序列全长3 422 bp，包含1个2 595 bp的开放阅读框(ORF)，1个294 bp的5′非编码区(5′UTR)和1个533 bp的带有加尾信号的3′非编码区(3′UTR)(图3)．由其推导DenSIZ1的氨基酸序列总长为864个氨基酸，理论相对分子量约为94.90×103，等电点pI为5.04，属于不稳定蛋白家族类，这些为DenSIZ1蛋白的提取、分离纯化及植物介导的RNAi研究提供了基础数据．

M: 250 bp DNA Ladder marker; 1: 3′RACE PCR product of GSP1 and 3′CDSⅢ as primers(2 511 bp); 2: PCR product of GSP2 and 3′CDSⅢ as priemrs(2 320 bp); 3: PCR product of GSP3 and 3′CDSⅢ as primers(2 304 bp).

图1DenSIZ1 3′RACE PCR扩增
Figure 1 3′RACE PCR amplification ofDenSIZ1 gene

M: 250 bp DNA Ladder marker; 1～10:DenSIZ1 PCR products(2 615 bp).

图2DenSIZ1全长基因PCR扩增
Figure 2 PCR amplification ofDenSIZ1 gene

2.3DenSIZ1蛋白的性质

SIZ1蛋白属于SUMO E3酶家族，将不同SUMO E3酶家族成员与DenSIZ1的氨基酸序列构建进化树进行同源性分析(图4)，发现DenSIZ1与AtSIZ1[4]同源性较高，亲源性较近.DenSIZ1与PIAS家族聚类在一起，表明DenSIZ1可能属于SUMO E3 ligase的PIAS家族蛋白，具有靶蛋白特异性及促进SUMOs与靶蛋白结合的特性．

黑体标记核苷酸为5′UTR及3′UTR序列

TMHMM在线分析软件分析表明DenSIZ1多肽链中不存在跨膜结构区．DictyOGlyc预测表明DenSIZ1只有1个位于第555位的丝氨酸糖基化位点．经NetPhos2.0 Server 磷酸化位点分析结果表明DenSIZ1氨基酸序列共有53个磷酸化位点，均匀分布于整个多肽链中．DenSIZ1蛋白质二级结构预测其主要包含随机卷曲、α-螺旋和延伸链，分别占60.42%、18.63%、20.95%，散布于整个蛋白质结构中．随机卷曲与延伸链之和占整个二级结构链的81%，表明DenSIZ1的功能结构域主要在α-螺旋形成的区域．

Rattusnorvegucus:褐鼠；Musmusculus:小白鼠；Homosapens:智人；BosTaurus:黄牛；Gallusgallus:鸡；Schizosaccharomycespombe:栗酒裂殖酵母；Arabidopsisthaliana:拟南芥；Ricinuscommuis:蓖麻;Dendrobium:石斛兰；Xenopuslaevis:蟾蜍；Salmosalar：大西洋鲑；Saccharomycescerevisiae: 酵母

图4 DenSIZ1蛋白的分子进化树分析

Figure 4 The phylogenetic tree analysis of DenSIZ1 protein

通过Pfam在线分析，DenSIZ1存在3个功能结构域，即SAP、PHD、zf-MIZ(图5).SAP功能结构域由第11～45位氨基酸形成，是某些酶具有特定结合DNA活性的重要功能域，推测其为DNA结合结构域[5]．PHD功能域由第114～169位氨基酸组成，形成一个锌指结构，具有PHD结构域的核蛋白参与染色质调节的转录过程．第360～409位氨基酸形成zf-MIZ(MIZ/SP-RING zinc finger)保守结构域．SUMO E3酶SP-RING结构域功能是SUMO化酶所特有的，SP-RING Zn指结构域结合上Ubc9(SUMO E2酶)与底物形成的复合物，提高底物SUMO化速率[6]．

图5 DenSIZ1的功能结构域分析

Figure 5 Functional domain analysis of DenSIZ1

SAP结构域参与DNA转录、RNA加工等过程，PHD结构域参与染色质调节的转录过程．这2个功能域都需与染色体结合才能行使其功能，推测DenSIZ1蛋白可能定位于含有染色体的亚细胞结构．而DenSIZ1与AtSIZ1具有高度同源的SAP和PHD结构域，AtSIZ1定位于细胞核．推测DenSIZ1蛋白可能定位于细胞核或叶绿体．这些还有待实验证实.

3 讨论

SUMO化修饰作为蛋白翻译后修饰的一种重要形式，是蛋白质发挥生物学功能的重要调节机制．基因翻译后修饰作用对蛋白的功能具有重要影响，蛋白质必须进行修饰，才能成为具有生理功能的活性蛋白[7]．本文预测，DenSIZ1只有1个糖基化位点，有53个磷酸化位点．对跨膜区的预测发现DenSIZ1没有跨膜区，是一个非膜结合蛋白．蛋白行使功能部位可能是细胞质、胞质溶胶、各细胞器和细胞核．通过WOLF PSORT预测进一步定位DenSIZ1可能分泌至细胞核，此预测与其同源蛋白AtSIZ1定位于细胞核的研究相同．

现已发现3类SUMO E3酶：PIAS家族、RanBP2家族和Pc2家族[8]．PIAS家族和RanBP2家族都具有1个环状结构，对PIAS家族蛋白来说是必需的，PIAS家族蛋白的活化需要环状结构域，而RanBP2家族蛋白则不需要[9]．对DenSIZ1蛋白的三维结构分析，发现DenSIZ1可能具有2个重要的zf-MIZ锌指环状结构和PHD锌指环状结构，表明DenSIZ1可能属于PIAS家族SUMO E3酶，但目前未知2个环状结构是否都对蛋白活化起作用．

利用生物信息学技术对目标靶基因进行结构和功能预测成为一项重要的科研技术策略．SIZ1是SUMO化途径中的重要SUMO E3酶，参与靶蛋白的选择及靶蛋白的连接，在植物非生物应激反应和植物开花周期中起着重要调节作用．该研究从石斛兰基因组中克隆到SIZ1基因，进行了详细的生物信息学分析与预测，为进一步研究石斛兰SIZ1基因的功能和完善植物SUMO化途径的生理功能奠定理论基础．

[1] JING B J,YIN H J,JIYOUNG L,et al.The SUMO E3 ligase,AtSIZ1,regulates flowering by controlling a salicylic acid-mediated floral promotion pathway and through affects onFLCchromatin structure[J].The Plant Journal,2008,53:530-540.

[2] MIURA K,RUS A,SHARKHUU A,et al.TheArabidopsisSUMO E3 ligase SIZ1 controls phosphate deficiency responses[J]. Proc Natl Acad Sci USA,2005,102:7760-7765.

[3] MIURA K,JIN J B,LEE J,et al.SIZ1-mediated sumoylation of ICE1 controls CBF3/DREB1A expression and freezing tolerance inArabidopsis[J].Plant Cell,2007,19:1403-1414.

[4] 徐庞连，曾棉炜，黄丽霞，等.植物SUMO化修饰及其生物学功能[J].植物学通报，2008，25(5)：608-615.

XU Panglian,ZENG Mianwei,HUANG Lixia,et al.SUMOylation and its biological function in plants[J].Chin Bull Bot,2008,25(5):608-615.

[5] ARAVIND L,KOONIN E V.SAP-a putative DNA-binding motif involved in chromosomal organization[J].Trends Biochem Sci,2000,25:112-114.

[6] DEYRIEUX A F,ROSAS-ACOSTA G,OZBUN M A,et al.Sumoylation dynamics during keratinocyte differentiation[J].J Cell Sci,2007,120(1):125-136.

[7] 阎隆飞，张玉麟.分子生物学[M].北京:中国农业大学出版社，2005:259-262.

[8] JOHNSON E S.Protein modification by SUMO[J].Annu Rev Biochem,2004,73:355-382.

[9] 叶晓峰，吴乔.类泛素蛋白——SUMO[J].细胞生物学杂志，2004，26(1):10-15.

YE Xiaofeng,WU Qiao.SUMO,a ubiquitin-related protein[J].Chinese Journal of Cell Biology,2004,26(1):10-15.

Keywords：Dendrobium; SUMO E3 ligase; gene cloning; sequence analysis

【责任编辑 成 文】

CLONINGANDSEQUENCEANALYSISOFSIZ1GENEINDENDROBIUM

WANG Yaqin1,2*, ZHONG Kaixin1, YANG Chengwei2, LIANG Shan2

(1.School of Bioscience & Bioengineering, South China University of Technology, Guangzhou 510006, China; 2.Guangdong Key Lab of Biotechnology for Plant Development, School of Life Science, South China Normal University, Guangzhou 510631, China)

A SIZ1-like gene was firstly cloned fromDendrobiumcDNA library and named asDenSIZ1. Using the bioinformatics software, the physical and chemical properties, composition,secondary structure, tertiary structure, subcellular localization and functional structure domain were analysized and predicted. These results showed thatDenSIZ1 probably belongs to PIAS family member of SUMO E3 ligase and includes three important function domains of SAP, PHD and zf-MIZ. Moreover, it is located in cellular nucleus and has higher homology with PIAS family.

2010-12-20

国家自然科学基金项目(30970216)；863资助项目(024-D90661)；广东省自然科学基金项目(07006553)；广东省科技计划项目(2007A020100001)

*通讯作者,yqwang@scut.edu.cn

1000-5463(2011)02-0119-05

Q785

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