作为基因输送载体的壳聚糖衍生物研究进展

李 晏

(解放军第411医院，上海 200081)

作为基因输送载体的壳聚糖衍生物研究进展

李 晏

(解放军第411医院，上海 200081)

壳聚糖作为基因载体，目前存在的主要问题是还不能达到足够高的表达效率。其中主要原因是壳聚糖在pH 7.4的生理环境下溶解度较差，壳聚糖与DNA形成的复合物在生理环境下的稳定性较差，缺乏细胞靶向性。本文综述了作为基因输送载体的壳聚糖衍生物研究进展，为进一步研究和开发壳聚糖衍生物提供依据和参考。

基因载体；壳聚糖；衍生物

基因输送载体大体上分为病毒和非病毒两类。以病毒作为基因输送载体是指将病毒基因中编码中致病因素部分去除掉，以目标基因替代之。由于控制病毒进入靶细胞，在细胞内的运输以及编码病毒进入细胞核部分的基因还在病毒载体上，所以病毒载体的突出优点就是有较高的靶基因表达效率。但同时也保留了一些病毒的缺点：如具有较强的免疫反应、可以随机地插入靶细胞的基因组可能会激活原癌基因从而引发肿瘤发生，并且大量制备过程非常复杂，这些都成为病毒载体应用于临床的限制因素。非病毒载体主要有以下几种：脂质体、阳离子多聚物、重组蛋白和无机的纳米粒子。脂质体也是目前研究较多的一种非病毒的载体，包括阳性、中性及阴性脂质体。阳离子多聚物包括天然的阳离子多聚物如壳聚糖、胶原和人工合成的阳离子多聚物如聚乙烯亚胺、聚丙烯亚胺树突状物及多聚赖氨酸等。壳聚糖作为一种天然存在的阳离子多聚物，具有较好的生物相容性和生物降解性，可以与DNA通过快速混合形成纳米颗粒，从而具有作为基因输送载体的重大潜力。本文将主要对作为基因载体的天然阳离子多聚物壳聚糖及其衍生物研究进展进行综述。

1 壳聚糖作为基因载体的优势和不足

壳聚糖不溶于水和一般的有机溶剂，但能溶于大部分有机酸的水溶液而形成一种玻璃状的胶状物。由于壳聚糖在pH<6的酸性溶液中氨基可以质子化带正电荷，增强了壳聚糖的溶解性能，这种性质使质子化带正电荷的壳聚糖在水相中与带有负电荷的DNA通过快速混合形成纳米级的复合物。壳聚糖与DNA形成的复合物可以使DNA凝聚，并且可以保护DNA免受核酸酶的降解。同时壳聚糖还有较好的生物相容性和生物可降解性。基于以上特性，壳聚糖作为基因输送载体的研究引起了人们广泛的兴趣。而壳聚糖作为基因载体现在的主要问题是还不能达到足够高的表达效率。其中主要原因在于壳聚糖在pH 7.4的生理环境下的溶解度较差，壳聚糖与DNA形成的复合物在生理环境下的稳定性较差，缺乏细胞靶向性。因此，近年来为克服这些局限性，壳聚糖的衍生物研究成为一个非病毒载体的研究热点。

2 作为基因载体的壳聚糖衍生物的研究进展

2.1提高壳聚糖与DNA复合物稳定性的壳聚糖衍生物 虽然阳离子复合物的正电性在细胞转染研究中是有利的，但是在动物全身给药实验，阳离子复合物的阳离子与血液中的阴离子成分如血清白蛋白、调理素等结合后产生聚集，从而被网状内皮系统、吞噬细胞迅速清除，使得阳离子复合物体内半衰期缩短。

为减少阳离子复合物与血浆蛋白的非特异结合，一些研究采用亲水性的机团如PEG等修饰阳离子聚合物[1]，聚乙烯亚胺采用PEG修饰后能够增加复合物的稳定性，从而增加了复合物粒子静脉注射后的体循环时间，其主要原因可能是因为高度灵活的PEG链能够干扰阳离子复合物与血浆成分的非特异结合[2]。另外复合物表面的PEG链的存在还能够减少复合物粒子的聚集，从而提高其稳定性。有研究表明PEG接枝的PEI共聚物(PEI-g-PEG)中PEG的取代度和PEG的分子量影响共聚物的理化性质，分子量为20 kDa的PEG较分子量为0.5 kDa的PEG接枝的聚合物能形成更小的复合物粒子[3，4]。

壳聚糖的PEG修饰对于壳聚糖/DNA复合物在不同细胞中转染效率的研究近年来相继有文献报道，其基本结论是壳聚糖经过PEG修饰后可以显著提高含血清细胞培养研究的转染效率。PEG接枝的壳聚糖共聚物(MW=5 kDa，接枝率9.6%)能够显著降低血清和胆汁存在是复合物聚集情况。体内实验研究表明，与壳聚糖相比，PEG接枝的壳聚糖共聚物在胆管注射1 d以及门静脉置管3 d的大鼠肝中有更好的基因表达[4]，这主要是由于壳聚糖经过PEG化后减少了调理作用，延长了复合物血循环时间。进一步的研究PEG接枝的壳聚糖不仅能够减少大鼠Kupffer细胞的清除作用，并能够增加到达肝脏和肿瘤部位的转染物质的量[5]。

2.2增加壳聚糖与DNA复合物靶向性的壳聚糖衍生物 由于聚合物缺乏细胞靶向性，壳聚糖纳米粒的细胞摄取作用主要是通过非特异性的细胞内吞实现，这就受到纳米粒表面特性的影响。为改善对于细胞摄取效率和靶细胞的特异性，壳聚糖常与细胞特异性的配体结合，通过这些配体可以识别和结合靶细胞上膜结合蛋白。当纳米粒达到靶细胞，阳离子粒子与阴离子细胞膜结合，ATP驱动的细胞摄取纳米粒。而特异性配体(受体)修饰的壳聚糖载体与DNA/SiRNA复合物的细胞摄取能够通过受体介导的内吞作用进行。已有研究的与壳聚糖结合的受体包括转铁蛋白[6]、叶酸、甘露糖[7]、半乳糖[8]。其中叶酸被细胞摄取的机制有利于叶酸结合的壳聚糖载体更具靶向性，从而改善其转染效率。叶酸修饰的纳米粒具有较低的毒性、较好的DNA缩合作用、正电性和118 nm左右的粒子大小，这些特征使得叶酸结合的壳聚糖载体有望成为较好的非病毒载体[9]。Park等[8]研究了半乳糖修饰的壳聚糖/DNA复合物，由于复合物上半乳糖的靶向性，该系统在表达肝细胞表面去唾液酸糖蛋白受体表现出了较强的转染效果。甘露糖修饰的壳聚糖Gal-PEG-CHI-g-PEI载体在体外(HepG2和Hela细胞)和体内(静脉注射)基因治疗中均提高了转染效率和肝细胞选择性[10]。

影响配体结合壳聚糖载体靶向性的因素主要有：配体的取代度、生物交联的化学方法、配体和聚合物的空间大小以及配体和受体的结合强度等。配体对于靶细胞的选择性也受到复合物表面电荷的影响。复合物表面正电性过强会促进吸附依赖型的细胞摄取，造成细胞选择性的下降[11]。复合物表面电荷可通过结合具有柔性骨架的亲水性高分子如PEG解决。在靶向配体和阳离子聚合物之间接入PEG，还能够增加配体出现在复合物表面的机会。

2.3提高壳聚糖与DNA复合物内含体逃逸功能的壳聚糖衍生物 影响壳聚糖DNA复合物转染效率的因素除了较差的稳定性和非选择性之外，该复合物较难从内含体中释放进入胞浆中也是一个重要因素。为克服内含体屏障，许多研究策略得到了应用。一些外源性物质掺入复合物中，如擒酶体药氯喹[12]，融合肽[13]，以及pH敏感的中性脂质材料。然而氯喹的细胞毒性、免疫原性以及副作用限制了其在基因治疗中的作用[14]。融合肽在生理环境下呈现两亲性的α-螺旋结构，这有助于穿透内含体膜[13]。pH敏感的中性脂质如二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)能够作用于内含体膜，从而促进复合物和膜的融合加速DNA的内含体逃逸。

Kiang等[15]研究表明壳聚糖/DNA复合物中添加聚丙烯酸(PPAA)后明显增加了转染效率，聚丙烯酸是一种pH高度敏感的高分子，在pH低于6.0时具有较高的膜破坏能力，从而促进复合物的内含体逃逸。咪唑丙烯酸偶联壳聚糖在293T细胞也表现出较强的转染效率，并且随着咪唑丙烯酸的增加转染效果增强，这是由于咪唑丙烯酸中的咪唑环具有较强的质子海绵效应，呈现出内含体逃逸作用。聚乙烯亚胺(PEI)接枝的壳聚糖同样由于其内含体逃逸作用增强表现出较强的转染效率[16]。但是，偶联内含体逃逸功能成分的作用一定程度上会受到壳聚糖自身质子化程度的影响。

2.4壳聚糖自身的结构修饰 壳聚糖/DNA复合物对于pH的敏感性影响了复合物的稳定性和转染效率。为改善壳聚糖在生理环境下的水溶性和提高转染效率，近年来壳聚糖自身的结构修饰取得了较大的发展。

2.4.1亲水性壳聚糖衍生物 为了解决壳聚糖溶解度问题，研制一系列的亲水性壳聚糖衍生物，如壳聚糖季铵盐[17]、PEG化的壳聚糖、PEG化的三甲基壳聚糖[18]以及低分子量的水溶性壳聚糖。近期研究精氨酸偶联的壳聚糖通过精氨酸上的NH2-显著改善了水溶性，在HEK 293细胞和COS-7细胞提高了转染效率。Satoh等[19]研究了6-氨基-6-脱氧-壳聚糖，该衍生物在中性pH环境下溶解，在COS-1细胞中有较好的转染效果。葡聚糖和PVP[20]修饰的壳聚糖也改善了生理环境pH条件下壳聚糖的溶解度。

有关的体内基因转染研究证实载pDNA的季铵化的壳聚糖(60%的三甲基壳聚糖)复合物通过胃肠道黏膜给药，能有效表达绿色荧光蛋白。Wong等[21]合成了PEI-g-壳聚糖，通过次乙亚胺形成阳离子水溶性壳聚糖，体内外研究表明PEI 25K接枝的聚合物具有较低的毒性和较高的转染效率。进一步降低PEI的分子量(600 Da和12 KDa)能够减小细胞毒性，对于293T细胞和Hela细胞的转染没有明显影响。

2.4.2疏水性壳聚糖衍生物 疏水性基团偶联到非病毒载体上能够增强复合物与细胞的相互作用从而增加转染效率，如吸附在细胞表面、增强细胞摄取等[22]。壳聚糖与DNA的静电吸附作用较强，一定程度上限制了基因物质从载体上的解吸附作用，继而影响在细胞核中的表达。疏水性基团偶联壳聚糖能够有助于DNA从载体上的解吸附作用，实现较好的转染效率。这方面的研究包括：脱氧胆酸壳聚糖[23]，N-烷基化壳聚糖[24]，5β-胆烷酸对羧甲基壳聚糖进行疏水改性，硬脂酸壳聚糖[25]等。各复合物的转染效率高度依赖于取代度。

Lee等[23]合成了脱氧胆酸壳聚糖(DAC)，与DNA形成复合物后能提高COS-1细胞的转染效率；但是在有血清的COS-1细胞中转染效率明显下降。与之不同，脱氧胆酸偶联的壳寡糖(DACO)纳米粒表现出了非常高的转染效率，由于DACO的两亲性特征，即使在血清的存在下，其在HEK293细胞有较好的转染效果。Liu等[24]制备了N-烷基化壳聚糖，由于烷基侧链的存在，在C2C12细胞转染效率有所增加，但是当烷基侧链多余8个碳时转染效率下降。Yoo等制备了5 β-胆烷酸羧甲基壳聚糖(CGC)，研究表明随着CGC用量的增加，DNA的包裹率增加，而复合物纳米粒粒径减小，相应的在有血清条件下的COS-1细胞体外转染效率提高。Hu等[25]研究了硬脂酸壳寡糖，在A549细胞中的转染研究表明，该复合物可以持续增加转染效果达72 h，而商品化试剂LipofectamineTM 2 000由于其细胞毒性，作用仅能持续24 h。为进一步改善壳聚糖衍生物的转染效率，开展了大量的次级衍生物研究。如半乳糖基壳聚糖接枝葡聚糖、三甲基壳聚糖接枝聚(N-异丙基丙烯酰胺)共聚物等[26]。

3 壳聚糖衍生物作为基因载体的前景展望

虽然为实现较好的转染效果，壳聚糖衍生化研究不断深入，但是距离可供临床应用的非病毒载体的要求还有不足。壳聚糖衍生物的研究主要有以下3个方面特点：①壳聚糖作为一种阳离子高分子，能够有效缩合DNA/siRNA，实现较为理想的细胞核递送。②接枝亲水性基团如PEG，增加了水溶性和生物体内稳定性。③为增强对于靶细胞的选择性，接枝特异性配体的壳聚糖研究方兴未艾。相信随着研究的深入，结合复合物形成的制剂因素和壳聚糖载体的结构改造，以壳聚糖为骨架的非病毒基因载体将取得长足进步。

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2010-09-20

[修回日期] 2010-10-21

Researchprogressofchitosanderivativesasgenedeliveryvector

LI Yan

(Department of Pharmacy, 411th Hospital of PLA, Shanghai 200081,China)

Despite the advantages of chitosan as a non-viral gene delivery vector, the application of this system is significantly limited by its poor solubility (the amino groups on chitosan are only partially protonated at physiological pH 7.4), poor stability of the polyplex at physiological pH, low cell specificity and therefore low transfection efficiency. Chitosan structure modification or additive incorporation is an effective way to improve the stability of the polyplex in biological fluids, enhance targeted cell delivery and facilitate endo-lysosomal release of the complex. In this paper, chitosan derivatives as gene delivery vector were reviewed to facilitate the process of chitosan vector development for clinical application.

gene delivery vector；chitosan；derivative；review

李 晏(1969-)，女，药学硕士，副主任药师.

R94

A

1006-0111(2011)01-0008-04