凋膜止崩液对无排卵性功血大鼠子宫内膜组织ER、ERα及ERβ表达的影响*

贺丰杰 李小宁 张 倩 白 俊

凋膜止崩液对无排卵性功血大鼠子宫内膜组织ER、ERα及ERβ表达的影响*

贺丰杰 李小宁 张 倩 白 俊

目的：探讨凋膜止崩液宫腔靶向给药治疗无排卵性功能失调性子宫出血（功血）子宫内膜增生症的可能机制。方法：选取健康成年SD雌性大鼠48只，分为空白组、模型对照组、实验小剂量组和实验大剂量组，建立无排卵性功血子宫内膜增生症模型。凋膜止崩液宫腔内给药后3 d处死，留取子宫标本，采用免疫组化技术检测各组大鼠子宫内膜组织中雌激素受体（ER）、ERα及ERβ的表达水平。结果：模型对照组ER、ERα、ERβ的表达高于空白组，实验大、小剂量组ER、ERα、ERβ的表达低于模型对照组，差异均有统计学意义（均P＜0.001），实验大剂量组ER、ERα和ERβ水平低于实验小剂量组，差异有统计学意义（P＜0.01）。结论：凋膜止崩液通过下调ER、ERα及ERβ阻断了雌激素发挥效应的通路，抑制子宫内膜的持续性增生从而治疗子宫内膜增生症。

功能性子宫出血 子宫内膜增生 受体,雌激素 雌激素受体α 雌激素受体β 凋膜止崩液

子宫内膜增生症是无排卵性功能失调性子宫出血（功血）常见的病理类型，是一种激素依赖性疾病。由于异常大量子宫出血常导致贫血，并且病理学的研究发现子宫内膜从超出正常增生期到癌前的增生形成一个连续的谱[1]，属于妇科疑难病症。增生的子宫内膜含有雌激素受体（ER），ER有ERα和ERβ 2种亚型，ER及其亚型在子宫内膜增生症的发展过程中起重要作用[2]。本研究通过建立子宫内膜增生症大鼠模型，探讨ER及其亚型在子宫内膜增生症发病中的作用，并通过中药凋膜止崩液宫腔靶向治疗，观察在用药后ER及其亚型在子宫内膜组织中的表达变化，从而揭示凋膜止崩液治疗子宫内膜增生症的可能机制，为临床推广中药宫腔靶向治疗无排卵性功血提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物模型建立及分组 健康成年SD雌性大鼠48只，体质量（200±20）g，购自西安交通大学医学院动物实验中心。适应性喂养3 d后，将大鼠随机分成空白组、模型对照组、实验小剂量组和实验大剂量组，每组12只。造模：空白组仅行开关腹手术，其余3组大鼠均去掉卵巢组织，术后3d，空白组大鼠肌内注射花生油1.5 μL/g，其余3组大鼠均肌内注射苯甲酸雌二醇1.5 μL/g，隔日1次，连续14次后各组随机处死2只取其子宫内膜组织，经病理证实为子宫内膜增生症，表示造模成功。每组剩余10只大鼠进行后续实验，3 d后，模型对照组大鼠双侧子宫腔注入生理盐水0.6 mL（0.3 mL/侧）；小剂量组大鼠注入凋膜止崩液0.6 mL（0.001 6 g/mL，0.3 mL/侧）；大剂量组大鼠注入0.6 mL（0.003 3 g/mL，0.3 mL/侧）。宫腔注药3 d后处死。

1.2 实验药物 凋膜止崩液由鸦胆子、莪术及元胡3味药物组成，由陕西中医学院药学系提供，经生药学鉴定符合中国药典2005年版规定的质量标准。提取有效部位群（鸦胆子提取鸦胆子油、莪术提取莪术油）。根据前期实验，按照提取物∶乳化液∶生理盐水=1∶1∶8的比例加入吐温-80和生理盐水，配成乳化剂。用药剂量按照人∶大鼠=6.25∶1的比例给予。苯甲酸雌二醇针剂（1 g/L），上海第九制药厂。兔抗人、大鼠、小鼠ER、ERα、ERβ多克隆抗体及免疫组化SP-0023分析药盒购自西安阿尔宝生物技术有限责任公司。

1.3 子宫内膜ER、ERα、ERβ测定 采用免疫组化染色SP法，检测程序按试剂盒说明书进行。取大鼠子宫组织，立即置于4%多聚甲醛固定液中，常规脱水、石蜡包埋，统一切片后，加入一抗、二抗、辣根酶标链霉素，最后用DAB染色。用已知表达ER、ERα、ERβ的乳腺癌组织切片作阳性对照[1]，用PBS代替一抗作阴性对照，结果判断以上皮细胞核出现黄色或棕褐色颗粒为阳性反应，每张组织切片取5个高倍视野（×200倍），每个视野计数100个细胞计算阳性细胞百分率，取平均百分率为显色指数。

1.4 统计学方法 采用SPSS 17.0统计软件处理，数据以均数±标准差（）表示，多组比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠子宫内膜组织中ER、ERα及ERβ的表达水平比较 模型对照组的ER、ERα、ERβ表达水平高于空白组，实验大、小剂量组的ER、ERα、ERβ表达水平低于模型对照组，差异均有统计学意义（均P＜0.001），实验大剂量组的ER、ERα和ERβ水平低于实验小剂量组，差异有统计学意义（均P＜0.001）。

Table 1 Comparison of expressions of ER,ER α and ER βbetween four groups表1 各组ER、ERα及ERβ表达水平比较 （%）

Table 1 Comparison of expressions of ER,ER α and ER βbetween four groups表1 各组ER、ERα及ERβ表达水平比较 （%）

**P<0.01

组别空白组模型对照组实验小剂量组实验大剂量组F n 10 10 10 10 ER 35.17±2.63 65.82±2.52 43.91±4.37 40.36±3.89 182.33**ERα 37.24±2.37 78.64±2.15 44.72±3.99 40.23±3.46 410.01**ERβ 39.74±2.56 76.43±2.91 40.07±4.06 37.23±3.28 311.01**

2.2 各组大鼠子宫内膜组织中ER、ERα及ERβ的表达 对于ER、ERα和ERβ，均是空白组阳性细胞呈少量、散在分布；模型对照组中呈现较多含棕黄色颗粒的阳性细胞；实验小剂量组均可见少量白细胞浸润，阳性细胞较模型对照组减少；实验大剂量组内膜上皮脱失，腺体消失，可见大量炎细胞浸润，偶见阳性细胞，见图1~3。

Figure 1 The expression of ER in uterine tissues of four groups（Immunohistochemistry×200）图1 各组大鼠子宫内膜组织中ER的表达（免疫组化×200）

Figure 2 The expression of ERα in uterine tissues of four groups（Immunohistochemistry×200）图2 各组大鼠子宫内膜组织中ERα的表达（免疫组化×200）

3 讨论

Figure 3 The expression of ERβ in uterine tissues of four groups（Immunohistochemistry×200）图3 各组大鼠子宫内膜组织中ERβ的表达（免疫组化×200）

子宫内膜增生症是由于神经内分泌失调导致卵巢无排卵，子宫内膜长期受单一雌激素刺激无孕酮拮抗形成病理性增生过度。雌激素在女性生殖功能中起不可替代的作用，它主要通过与ER结合而发挥生物学作用。人类的ERα和ERβ有相同的外显子，但ERβ对雌二醇的亲和力较ERα低[3]，提示很可能在循环雌二醇浓度升高时ERβ才被激活。钱洪浪等[2]在对绝经过渡期女性子宫内膜病变ERα、ERβ的研究中发现，子宫内膜过度增生组ERα的表达较增生期子宫内膜增加，而ERβ的表达无明显改变。因此子宫内膜的增殖作用主要是通过ERα途径介导的，ERβ的确切作用不明[4]。王言奎等[5]研究表明在增生子宫内膜组中ERβ mRNA的平均表达水平高于正常子宫内膜组，ERβ mRNA的升高与子宫内膜增生的发病相关。ERβ在促进子宫内膜过度增生乃至进一步癌变方面发挥着作用[3]。以上研究表明ERα、ERβ与子宫内膜增生症的发病有密切联系。

本实验通过切除大鼠卵巢，排除了卵巢排卵和孕激素的影响，利用雌激素负荷法单一刺激大鼠，建立起无排卵性功血子宫内膜增生症大鼠模型。既往研究证实，雌激素一方面促进内膜细胞增生和血管增殖，另一方面可以使内膜细胞增生过程中在DNA复制转录水平上诱导ER的生成[6]。本实验中模型对照组与空白组比较，ER、ERα、ERβ表达均明显升高，也表明雌激素可以促进ER及其α、β亚型的合成，从而更有利于雌激素发挥生物学效应。随着对ER研究的不断深入，人们发现激素靶器官对激素的反应不仅取决于循环中的激素浓度，也取决于靶器官中受体的含量[7]。所以当激素水平或子宫内膜组织相应的受体含量改变或受体功能异常时，都可能造成子宫内膜形态和功能上的病理改变。低水平的雌激素可以因为子宫内膜中ER含量增高而发病[8]。在本实验中模型大鼠ER及其α、β亚型含量的升高，合力诱发了子宫内膜增生症。

中医认为，无排卵性功血辨病为崩漏，证属血瘀，治宜活血化瘀。凋膜止崩液由鸦胆子、莪术、元胡3味中药组成，具有活血化瘀、祛腐散结的作用。本实验使用凋膜止崩液靶向用药于大鼠宫腔，其结果显示，在同一时期大鼠增生子宫内膜组织中，用药后大、小剂量组大鼠ER、ERα、ERβ表达水平均较模型对照组明显下降。推测凋膜止崩液可能是通过下调ER、ERα、ERβ的含量，切断了雌激素发挥效应的途径，从而抑制子宫内膜持续生长，达到治疗子宫内膜增生症的目的。凋膜止崩液下调ER及其亚型的具体原因不明，既往文献中未见鸦胆子、莪术等中药抗雌激素及ER的报道，但已经证实鸦胆子、莪术是非特异性促细胞凋亡的中药[9-10]。本课题前期研究也经病理学证实此药方可使子宫内膜组织发生崩解、脱落[11]。推测凋膜止崩液下调ER及亚型可能与其促使子宫内膜细胞凋亡，使ER及亚型遭到破坏有关，此推测尚待进一步研究证实。

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Effects of Diaomozhibeng Liquid on the Expression of ER，ERα and ERβ of Uteri Endometrial Tissue in Rats with Endometrial Hyperplasia

HE Fengjie,LI Xiaoning,ZHANG Qian,BAI Jun

Shaanxi University of Chinese Medicine,Xianyang 712046,China

Objective:To explore the role and the possible mechanism of Diaomozhibeng liquid in rats with the endome⁃trial hyperplasia(EH).Methods:Forty-eight SD rats were divided into four groups including control group,model control group,the experimental low-dose group and the experimental high-dose group.The rat model of endometrial hyperplasia was induced with estrogen load.The Diaomozhibeng liquid was administrated in uterine cavity in rats.The expression levels of es⁃trogen receptor(ER),ERα and ERβ were checked by immunohistochemistry.Results:Compared with control group,expres⁃sions of ER,ERα and ERβ increased in rats of the model group(P<0.001).However,after treatment with Diaomozhibeng liq⁃uid,the expression of ER,ERα and ERβ significantly decreased(P<0.001).Expression levels of ER,ERα and ERβ were significantly lower in high-dose experimental group than those of low-dose experimental group(P＜0.05 or P＜0.01).Con⁃clusion:Diaomozhibeng liquid plays a role in endometrial hyperplasia by accelerating the ecclasis of uterine endometrial.One of mechanisms is maybe related to inhibiting the expression of ER,ERα and ERβ.

functional uterine bleeding endometrial hyperplasia receptors,estrogen estrogen receptor alpha estro⁃gen receptor beta diaomozhibeng liquid

10.3969/j.issn.0253-9896.2012.08.013

*国家自然科学基金资助项目（项目编号：30873354）；陕西省“13115”科技创新工程重大科技专项计划项目（项目编号：2008ZD⁃KG—81）

712046咸阳，陕西中医学院

（2011-12-30收稿 2012-03-12修回）

（本文编辑 闫娟）