柴胡皂甙d干预肺纤维化VEGF/PEDF表达的实验研究*

郑金旭 许 清 管淑红 刘继柱 宋 萍 汤 燕 吴立艳

柴胡皂甙d干预肺纤维化VEGF/PEDF表达的实验研究*

郑金旭 许 清 管淑红 刘继柱 宋 萍 汤 燕 吴立艳

目的：观察柴胡皂甙（SS）d对博来霉素（BLM）致肺纤维化小鼠的肺组织血管内皮生长因子（VEGF）/色素上皮衍生因子（PEDF）在不同时间表达变化的调节作用，并探讨其与抗肺纤维化作用的关系。方法：将80只小鼠随机均分为对照组，BLM组，SSd大、小剂量组。治疗组分别每天腹腔注射不同剂量SSd（2.0 mg/kg,1.0 mg/kg），分别于3、7、14及28 d时观察纤维化程度，样本碱水解法检测肺组织中羟脯氨酸（HYP）含量，免疫荧光观察PEDF、VEGF蛋白在肺内表达的规律，RT-PCR观察各时间点PEDF、VEGF mRNA表达的强度。结果：BLM组和SSd大、小剂量组均呈纤维化逐渐进展的动态变化，28 d时，SSd大、小剂量组纤维化程度较BLM组轻（P<0.01）；BLM组和SSd大、小剂量组HYP含量随时间增加逐渐增加，7、14及28 d时SSd大、小剂量组HYP含量均低于BLM组（P<0.001）；BLM组及SSd大、小剂量组VEGF表达从3 d时开始升高，第7天达高峰，后呈下降趋势，28 d达低点，PEDF表达总体呈逐渐增高趋势；SSd大、小剂量组VEGF表达比BLM组降低，PEDF表达升高（P<0.05或P<0.01）。结论：SSd能够抑制肺纤维化进展，机制可能与下调VEGF的表达，上调PEDF的表达有关。

柴胡皂甙 肺纤维化 血管内皮生长因子类 博来霉素 羟脯氨酸 RNA,信使 疾病模型,动物

肺纤维化是许多间质性肺病的共同结局，病理特征表现为成纤维细胞大量增殖和细胞外基质大量沉积，但其具体发病机制尚未完全清楚。研究表明，伴随着肺纤维化的进程，肺微血管密度呈现先增多后减少的特征，这种变化与纤维化进展息息相关[1-2]。血管内皮生长因子（VEGF）/色素上皮衍生因子（PEDF）是其中一对较重要的促/抗血管活性因子，目前对于VEGF/PEDF的动态变化尚少见报道。柴胡皂甙（SS）d是从传统中药中提取的有效单体成分，具有抗脂质过氧化，抑制转化生长因子（TGF）-β 1表达，抗血管生成等作用[3-4]。本研究旨在探讨SSd对肺纤维化小鼠VEGF/PEDF的调节作用及其抗肺纤维化的机制。

1 资料与方法

1.1 一般资料 （1）主要试剂：博来霉素（BLM）购自日本化药株式会社；SSd购自江西本草天工科技有限责任公司；羟脯氨酸（HYP）试剂盒、Masson染色试剂盒购自南京建成生物公司；兔抗小鼠VEGF、PEDF多克隆抗体购自Santa Cruz公司，CY3标记的羊抗兔二抗购自武汉博士德公司；RT-PCR试剂盒购自南京碧波生物公司。（2）实验动物：清洁级6周龄雄性昆明种小鼠80只，体质量18~22 g，由江苏大学实验动物中心提供。

1.2 方法

1.2.1 模型的建立及分组 将80只小鼠随机分为正常对照（Cont）组，博来霉素模型（BLM）组以及SSd大（2.0 mg/kg）、小剂量（1.0 mg/kg）组，每组20只。模型组和SSd大、小剂量组均采用BLM复制动物纤维化模型[5]，气管内一次性按体质量5 mg/kg注入BLM溶液0.04 mL（5 g/L），立即将动物直立并旋转2 min，尽可能让药液在肺内分布均匀，缝合皮肤，待动物自然清醒后放入笼内常规饲养。Cont组按上述造模方法气管内注入等体积生理盐水。SSd溶液的配置：分别取SSd 20 mg、10 mg，各溶入二甲基亚砜（DMSO）3 mL中，静置10 min，用生理盐水稀释至100 mL，避光保存。造模后，SSd大、小剂量组每天分别腹腔内注入0.2 g/L、0.1 g/L SSd溶液0.2 mL，BLM组和Cont组每天腹腔内注入0.2 mL生理盐水+DMSO（3 mL DMSO溶于97 mL生理盐水），连续28 d。

1.2.2 标本收集 给药第3、7、14及28天，每组分别随机处死5只小鼠，立即取出小鼠肺组织，右肺组织保存于-70℃冰箱，用于检测VEGF、PEDF mRNA以及HYP含量测定；左肺完整肺叶置于4%多聚甲醛溶液中固定，用于Masson染色以及免疫荧光检测。

1.2.3 病理切片观察 将多聚甲醛溶液固定好的左肺组织石蜡包埋，4 μm连续切片，做Masson染色，光镜下观察肺组织损伤程度及胶原纤维增生程度。纤维化程度评价，0级：正常肺组织，无或仅有少量细丝状胶原纤维。Ⅰ级：胶原纤维轻度增多，呈细束状。Ⅱ级：胶原纤维重度增多，融合成细带状，肺泡结构紊乱。Ⅲ级：胶原纤维明显增多，成宽带状或片状，肺泡塌陷融合。肺纤维化等级资料按0级计1分，Ⅰ级计2分，Ⅱ级计3分，Ⅲ级计4分转换为计量资料。

1.2.4 免疫荧光检测VEGF、PEDF蛋白表达规律 取包埋好的蜡块，2 μm连续切片，放入含10%牛血清白蛋白(BSA)的PBS孵育2 h以封闭非特异位点。封闭后分别加入VEGF一抗（1∶200）和PEDF一抗（1∶200），4℃冰箱过夜，充分洗涤后，用滤纸洗去多余水分，但不使标本干燥，加入一定比例的CY3二抗（1∶75），室温孵育30 min，再洗涤3次后封片。阴性对照用PBS代替一抗。于荧光显微镜下观察。HYP含量测定按照HYP测试盒说明书操作（样本碱水解法）。

1.2.5 PT-RCR检测VEGF/PEDF mRNA表达 采用Trizol一步法提取肺组织总RNA，反转录制备cDNA，以cDNA为模板，在反应体系中加入目的基因和内参照基因的引物，设定参数，进行目的基因的扩增。目的基因和内参照基因的引物序列：VEGF-F 5'-ACTCAATGCATGCCACGTGA-3',VEGF-R 5'-GCTGCCTGACACTGTGGTAATG-3'，扩 增 长 度 332 bp；PEDF-F 5'-ACGATACGGCTTGGACTCTGA-3'，PEDF-R 5'-AGACTTGGTAAGTTCGCCTTCG-3'，扩增长度 232 bp；内参 （GADPH） -F 5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3'，GADPH-R 5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'，扩 增 长 度440 bp。反应条件：94℃2 min进入循环，94℃30 s，59℃45 s，72℃1 min，36个循环，72℃延伸6 min。PCR的产物经1.5%的琼脂糖凝胶电泳并进行灰度分析。

1.3 统计学方法 采用SPSS 16.0软件进行统计学分析。计量资料数据以表示，多组间均数比较采用单因素方差分析，组间多重比较，如方差齐用LSD-t检验，方差不齐用Games-Howell检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 纤维化等级评分 各组3、7、14及28 d纤维化程度评分比较差异均有统计学意义（P<0.05），其中28 d时，SSd大、小剂量组与BLM组比较，差异亦有统计学意义（P<0.01），见表1。

Table 1 Comparison of scores of pulmonary fibrosis grading between four groups表1 各组给药后纤维化程度评分比较 （分）

Table 1 Comparison of scores of pulmonary fibrosis grading between four groups表1 各组给药后纤维化程度评分比较 （分）

*P<0.05，**P<0.01

组别Cont组（1）BLM组（2）SSd大剂量组（3）SSd小剂量组（4）F P（1）∶（2）（2）∶（3）（2）∶（4）（3）∶（4）n5 5 5 5 3 d 1.00±0.00 2.00±0.35 1.70±0.57 1.80±0.57 4.882*0.011 0.755 0.906 0.992 7 d 1.00±0.00 2.60±0.42 2.20±0.57 2.50±0.50 14.467**0.004 0.609 0.985 0.813 14 d 1.00±0.00 3.10±0.42 2.70±0.27 2.80±0.27 55.385**<0.001 0.041 0.116 0.587 28 d 1.00±0.00 3.80±0.27 2.90±0.42 3.00±0.35 75.156**<0.001<0.001 0.001 0.613

2.2 小鼠肺组织HYP检测结果 BLM组肺组织匀浆HYP水平从第3天开始升高，到第28天达高峰，与Cont组各时点比较差异均有统计学意义（P<0.001）。7、14及28 d时SSd大、小剂量组与BLM组HYP含量变化比较，差异有统计学意义（P<0.001）。14、28 d时SSd大、小剂量组间含量变化差异有统计学意义（P<0.05），见表2。

Table 2 Contents of HYP in four groups表2 各组肺组织匀浆HYP含量变化 （mg/g肺湿重）

Table 2 Contents of HYP in four groups表2 各组肺组织匀浆HYP含量变化 （mg/g肺湿重）

**P<0.01

组别Cont组（1）BLM组（2）SSd大剂量组（3）SSd小剂量组（4）F P（1）∶（2）（2）∶（3）（2）∶（4）（3）∶（4）n5 5 5 5 3 d 0.75±0.03 0.92±0.04 0.85±0.04 0.88±0.04 12.467**<0.001 0.038 0.235 0.305 7 d 0.73±0.04 1.15±0.05 0.89±0.05 0.90±0.04 62.577**<0.001<0.001<0.001 0.689 14 d 0.76±0.03 1.25±0.05 0.96±0.03 1.04±0.05 67.21**<0.001<0.001<0.001 0.043 28 d 0.76±0.02 1.58±0.06 1.17±0.08 1.26±0.06 127.870**<0.001<0.001<0.001 0.038

2.3 免疫荧光检测结果 BLM组及SSd大小剂量组VEGF蛋白表达从第3天开始增加，在第7天达到高峰，第14、28天呈逐渐下降趋势；VEGF蛋白的表达在纤维化增殖病灶内较少，而在非纤维增殖病灶区域内表达增多，见图1。BLM组及各SSd组PEDF蛋白的表达，总体上呈现随时间增加而逐渐增多的趋势；在区域上，纤维化程度较重的区域内，表达明显增多，而在纤维化程度较轻的区域，表达减少，见图2。

2.4VEGF、PEDF mRNA基因RT-PCR检测

2.4.1 PEDF mRNA的表达 BLM组PEDF mRNA表达在第3、7、14、28天表达总体呈现上升趋势，在第3、7天，基因表达水平仍低于Cont组（P<0.01）；SSd大、小剂量组各时点较BLM组PEDF mRNA表达水平升高，其中第7、14及28天差异均有统计学意义（P<0.05或P<0.01），SSd大、小剂量组于第7、14天差异有统计学意义（P<0.05），见表3、图3。

Table 3 The expression of PEDF mRNA in different groups表3 各组PEDF mRNA表达情况

2.4.2 VEGF mRNA的表达 BLM组VEGF mRNA表达从第3天开始增高，于第7天达到高峰，在第14、28天又逐渐下降，各时点其水平与Cont组比较，差异均有统计学意义（P<0.05）。SSd大、小剂量组各时点较BLM组VEGF mRNA水平降低，差异均有统计学意义（P<0.05或P<0.01）,SSd大、小剂量组第7、14天，差异有统计学意义（P<0.05），见表4、图4。

Table 4 The expression of VEGF mRNA in different groups表4 各组VEGF mRNA表达情况

Figure 4 Agar electrophoresis of VEGF mRNA in different groups图4VEGF mRNA琼脂凝胶电泳图

3 讨论

肺纤维化是一组多因素疾病，使用单一拮抗剂往往效果不佳，而一些中药常具有多种生物学成分，具有多通道、多靶点治疗复杂疾病的优势，并且对于全身的不良反应较小，因此，本研究选择研究SSd对其抗肺纤维化的作用。笔者曾研究了SSd对肺纤维化的保护作用[3]，王宝峰等[4]也对其抗肿瘤血管生成方面做了报道。研究表明，微血管的生成活性、肺动脉高压和肺纤维化病变的生成与总体预后有着密切联系[8]。VEGF/PEDF在不同层面上互相调节互相抑制的作用是体内微血管达到平衡状态的重要因素之一[6]。VEGF是一种特异作用于血管内皮细胞强有力的细胞因子，其在肺内可由巨噬细胞、上皮细胞、血管内皮细胞分泌，也可由肺间质细胞分泌[7]。在肺纤维化过程中，VEGF的大量分泌促进新的血管形成，并且提高了血管的通透性，导致蛋白质渗出，促进纤维化发展[8]，另外，VEGF还联同TGF-β1一起，促进细胞外基质的产生，直接促进纤维化的发展[1]。在肺纤维化病灶内，VEGF的降低通常伴有PEDF的升高。PEDF主要在气道、肺泡上皮细胞、血管内皮细胞和肺间质细胞内表达[9]。PEDF包含2个相应的功能抗原决定簇，34肽和44肽。34肽是负责抗血管生成方面的作用，可能连接于血管内皮细胞上的受体[10]。PEDF具有强烈的抑制血管生成的作用，能抑制VEGF诱导的血管生成，并且能够诱发内皮细胞凋亡，抑制成纤维细胞生长[11]。但是其直接在肺纤维化中的作用并不十分清楚，Zamiri等[12]研究认为，受损的上皮细胞表达PEDF在纤维化中很可能抑制成纤维细胞活性和局部炎症。

本研究结果显示，BLM组及SSd大、小剂量组的VEGF表达在第3天开始升高，到第7天达高峰，之后逐渐下降；PEDF的表达从第3天开始，呈现逐渐升高的趋势，到28天达高峰，表明肺纤维小鼠中VEGF/PEDF的平衡被打破，提示其血管生成活性的一种趋势为早期活性升高，后期活性下降，与文献[13]相似。SSd大、小剂量组28 d时纤维化程度评分和HYP含量与BLM组差异均有统计学意义，表明肺纤维化程度明显减轻，SSd可以通过下调VEGF的表达，上调PEDF表达抑制纤维化的进展。这种调节作用随着SSd剂量的增大而增强。结合本研究，笔者认为其抑制纤维化的原因可能为：（1）SSd调节VEGF/PEDF的平衡向抑制血管活性方向移动，通过抑制微血管的形成延缓纤维化的进展。（2）其下调VEGF的表达，直接抑制了细胞外基质的产生，抑制肺纤维化的发展。（3）其上调了PEDF的表达，也有利于抑制成纤维细胞的活性。

因此，笔者认为，SSd可以通过调节VEGF/PEDF的作用，明显抑制肺纤维化的进展，减轻肺纤维化的程度；但对于肺内严重纤维化，SSd治疗仍有风险，可能会加重肺动脉高压的症状。另外，根据肺纤维化进程中血管生成总体活性先升高后降低的变化，以及其分别在肺纤维病程中的作用，笔者推测，对肺纤维化疾病分阶段治疗，或许能成为以后研究的方向之一。

[1]Farkas L,Farkas D,Ask K,et al.VEGF ameliorates pulmonary hy⁃pertension through inhibition of endothelial apoptosis in experi⁃mental lung fibrosis in rats[J].J Clin Invest，2009，119（5）：1298-1311．

[2]Tachihara A，Jin E,Matsuoka T，et al.Critical roles of capillary en⁃dothelial cells for alveolar remodeling in nonspecific and usual in⁃terstitial pneumonias[J].J Nippon Med Sch，2006，73（4）：203-213．

[3]郑金旭，卢坤琴，夏德刚，等.柴胡皂甙d对博来霉素诱导肺纤维化小鼠的治疗作用及机制研究[J].中华医学杂志，2010，90（12）:808-812.

[4]王宝峰，程延安，王西京，等.柴胡皂甙D对实验性大鼠肝癌血管形成的抑制作用[J].世界华人消化杂志，2008，16（12）：1273-1280.

[5]陶章，李惠萍．不同剂量博来霉素致小鼠肺纤维化模型的比较[J].中国组织工程研究及临床康复，2009，13（7）：1214-1218．

[6]Xu Z，Fang S，Zuo Y，et al.Combination of PEDF with radiotherapy enhances the antitumor effects on nasopharyngeal carcinoma by down-regulating VEGF expression and angiogenesis[J].J Cancer Sci，2011，102(10):1789-1798．

[7]Tuder RM，Yun JH.Vascular endothelial growth factor of the lung:friend or foe[J].Curr Opin Pharmacol，2008，8(3)：255-260．

[8]Frankel SK，Cosgrove GP，Cha SI，et al.Riches DW:TNF-{alpha}sensitizes normal and fibrotic human lung fibroblasts to fas-in⁃duced Apoptosis[J].Am J Respir Cell Mol Biol ，2006，34（3）：293-304．

[9]Cosgrove GP，Brown KK，Schiemann WP，et al．Pigment epitheli⁃um-derived factor in idiopathic pulmonary fibrosis:a role in aber⁃rant angiogenesis[J].AM J Respir Crit Care Med，2004，170（3）：242-251．

[10]Filleur S，Volz K，Nelius T，et al.Two functional epitopes of pig⁃ment epithelial-derived factor block angiogenesis and induce dif⁃ferentiation in prostate cancer[J].Cancer RES，2005，65（12）：5144-5152．

[11]Ho TC，Chen SL，Yang YC，et al.PEDF induces p53-mediated apoptosis through PPAR gamma signaling in human umbilical vein endothelial cells[J].Cardiovasc Res，2007，76（2）：213-223．

[12]Zamiri P，Sugita S，Streilein JW.Immunosuppressive properties of the pigmented epithelial cells and the subretinal space[J].Chem Im⁃munol Allergy，2007，92：86-93．

[13]Ebina M，Shimizukawa M，Shibata N，et al.Heterogeneous increase in CD34+positive alveolar capillaries in idiopathic pulmonary fibro⁃sis[J].Am J Crit Care Med，2004，169（11）:1203-1208．

The Effect of Saikosapoin-d Intervention on VEGF/PEDF Expression in Experimental Pulmonary Fibrosis in Mice

ZHENG Jinxu，XU Qing，GUAN Shuhong，LIU Jizhu，SONG Ping，TANG Yan，WU Liyang

Department of Respiratory Medicine,The Affiliated Hospital of Jiangsu University,Jiangsu 212001,China

Objective:To investigate the effect of saikosapoin-d（SSd）on the expression of vascular endothelial growth factor(VEGF)/pigment epithelium-derived factor(PEDF)in lung tissue at different times,and to explore its relationship with anti-fibrosis in mice.Methods：Eighty mice were randomly divided into four groups:control group，model group(bleomycin,BLM)and two treatment groups(P<0.01)．Mice in treatment groups were injected intraperitoneally with SSd at different dos⁃es（2.0 mg/kg and 1.0 mg/kg）once per day．Samples of lung tissue were stained with Masson method.Hydroxyproline(HYP)content was evaluated.The expressive levels of VEGF and PEDF mRNA were observed by immunofluorescence.The expres⁃sive intensity of VEGF and PEDF mRNA was detected by RT-PCR at the 3 th，7 th，14 th and 28 th day．Results：In model group and SSd treatment groups,fibrosis was found gradually progressed,which was minor on 28 th day in SSd treatment group than that of BLM group(P<0.01).HYP levels increased gradually in BLM group and SSd group.HYP contents were lower on the 7 th，14 th and 28 th day in SSd treatment group than those of BLM group(P<0.001)．The expression of VEGF increased from the third day and reached the peak on the 7 th day in BLM group and SSd group.Then the expression of VEGF gradually decreased and reached the lowest level at 28 th day.The expression of PEDF presented tendency of elevation gradu⁃ally．In treatment groups，the expression of VEGF was lower than that in model group.The expression of PEDF mRNA was higher in SSd group than that in model group(P<0.05 or P<0.01)．Conclusion：SSd can inhibit pulmonary fibrosis in mice,which may be related to the down-regulation of VEGF and up-regulation of PEDF.

SAIKOSAPONIN pulmonary fibrosis vascular endothelial growth factors bleomycin hydroxyproline RNA,messenger disease models,animal

10.3969/j.issn.0253-9896.2012.08.014

*上海市自然科学基金项目（项目编号：10ZR1422600）；卫生部科研基金资助项目（项目编号：WKJ2006-2-026）

212001 江苏大学附属医院呼吸科

（2011-12-27收稿 2012-03-02修回）

（本文编辑 陆荣展）