Ghrelin对大鼠急性胃粘膜损伤的保护作用

吕俊旭，蒋 淼

(1.山西省人民医院消化科，山西太原 030012;2.复旦大学附属金山医院消化科)

Ghrelin是日本科学家Kojima发现的一种新的脑肠肽，是迄今发现的唯一的生长激素释放激素受体(GHSR)的天然配体[1]。Ghrelin由28个氨基酸残基组成，主要来源于胃粘膜X/A样细胞，胃切除手术后血浆Ghrelin水平明显下降[2-4]。Ghrelin作用的受体主要包括两类:一是生长激素促分泌受体1a(GHSR-1a），主要分布在下丘脑、腺垂体，有很强的促生长激素释放作用;另一种是GHSR-1b，广泛分布于胃肠道，但具体功能目前还不清楚。研究发现，Ghrelin不仅具有增加食欲、促进胃动力的作用，同时也是一种胃粘膜保护因子[5]。Sibilia的大鼠胃粘膜损伤实验显示，外源性Ghrelin对胃粘膜具有保护作用[6]。胃粘膜保护是一个多因素参与的复杂过程，其中比较重要的就是环氧化物酶(COX）系统。COX是催化花生四烯酸产生前列腺素(PGs)的限速酶，对维持胃粘膜的完整性，增加胃粘膜的血流具有重要作用[7]。目前，Ghrelin对胃粘膜的保护作用是否通过COXs起作用尚不清楚，因此，探讨Ghrelin对胃粘膜COX-1、COX-2表达水平的影响，对研究Ghrelin在胃粘膜保护和炎症反应中的作用机制具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 实验动物和试剂 健康SD大鼠64只(上海西普尔-必凯实验动物公司），体重400-500g，雌雄各半。Ghrelin(美国GenScript公司）按5μg/ml配制，PCR试剂盒(美国Invitrogen公司)，75%乙醇(上海利康消毒公司），PCR扩增仪(美国ABI公司）。

1.2 大鼠急性胃粘膜损伤模型的建立和分组 大鼠随机分为4组，每组16只大鼠(雌雄各半）:空白对照组，75%乙醇+生理盐水对照组(生理盐水组，NS组），75%乙醇+0.5μg Ghrelin干预组(0.5μg Ghrelin组，0.5μg GH组）和75%乙醇+5μg Ghrelin干预组(5μg Ghrelin组，5μg GH组）。实验前大鼠禁食24h，自由饮水。空白对照组大鼠仅腹腔注射生理盐水;其余三组大鼠于腹腔注射生理盐水或Ghrelin 1h后，予以75%乙醇(1ml/100g）灌胃，1h后麻醉大鼠取胃。

1.3 观察指标

1.3.1 大体标本观察:观察各组大鼠胃大体标本的变化。

1.3.2 评价胃粘膜损伤指数:各组随机选取8只大鼠，雌雄各半。取胃后10%甲醛固定30min，沿胃大弯剪开胃，展平置于解剖显微镜下(10×）观察胃出血性病灶，使用测微尺测量胃粘膜损伤面积，并参照文献计算胃粘膜损伤指数[8]。

1.3.3 组织学观察:1.3.2中的8只大鼠胃窦部取材，常规石蜡包埋，连续切片(片厚5μm），HE染色，光镜下观察胃粘膜损伤程度及炎细胞浸润程度。

1.3.4 荧光半定量PCR法检测大鼠胃粘膜COX-1和COX-2 mRNA的表达:取各组另外8只大鼠，麻醉后断头处死，取胃窦部液氮中保存。采用荧光半定量PCR法检测胃粘膜COX-1和COX-2 mRNA的表达。COX-1引物:上游5’-TTTGCACAACACTTCACCCACCAG-3’下游5’-AAACACCTCCTGGCCCACAGCCAT-3’，产物片段568bp;COX-2引物:上游5’-GTTGAAAGCCC TCTACCATGACA-3’，下游5’-TTGAGGCAGTGTTGA TGATCCT-3’，产物片段521bp;β-actin 引物:上游5’-ATCTGGCACCACACCTTCTACAATGAGCTGC-3’，下游5’-CGTCATACTCCTGCTTGCTGATCCACATC TGC-3’，产物片段828bp(引物均由上海生工公司合成）。Trizol法提取胃窦部粘膜组织的总RNA;按逆转录试剂盒说明操作逆转录合成cDNA;以β-actin为内参照行PCR 检测，反应条件为94℃ 60s、63℃ 45s、72℃ 60s，30个循环。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳分析后扫描，以COX-1和COX-2吸光度与β-actin吸光度的比值作为目的基因mRNA的相对表达水平。

1.4 统计学处理 采用SPSS 13.0统计软件处理数据，行方差分析，两两比较采用q检验。

2 结果

2.1 大体标本观察 生理盐水组大鼠胃粘膜几乎完全重度出血坏死，色泽发黑，粘膜脱落，组织松脆，触之易出血;0.5μg GH组大鼠胃粘膜大部分有明显糜烂出血，部分坏死，触之易出血;5μg GH组大鼠胃粘膜见部分斑片状糜烂出血，粘膜基本完整(图1，见封二）。

2.2 胃粘膜损伤指数 两个Ghrelin组大鼠的胃粘膜损伤指数明显低于NS组，差异具有统计学意义(P＜0.01），并且呈剂量依赖性(见附表）。

附表 各组大鼠胃粘膜损伤指数和COX-1、COX-2 mRNA的表达(±s，n=8）

附表 各组大鼠胃粘膜损伤指数和COX-1、COX-2 mRNA的表达(±s，n=8）

与NS组比较:*P＜0.01，**P＜0.05;与5μg GH组比较:#P＜0.01

组别 胃粘膜损伤指数 COX-1 mRNA COX-2 mRNA空白对照组 11±3.58* 0.57±0.04 0.26±0.02*NS 组 82±11.06 0.66±0.08 0.68±0.07 0.5μg GH 组 60±7.22*# 0.60±0.05 0.57±0.08**#5μg GH 组 41±6.10* 0.67±0.06 0.42±0.05*

2.3 HE染色结果 空白组大鼠胃粘膜结构正常;NS组大鼠胃粘膜细胞排列紊乱，失去完整性及连续性，部分区域粘膜上皮层缺失，损伤累及胃深部腺体，可见大量中性粒细胞、单核细胞、浆细胞浸润。0.5μg GH组大鼠胃粘膜各层排列欠整齐，损伤累及胃小凹及胃腺体，也可见中性粒细胞、单核细胞浸润。5μg GH组大鼠胃粘膜结构排列大部完整，部分胃腺体破坏，炎性细胞少见(图2，见封二）。

2.4 胃粘膜COX-1和COX-2 mRNA的表达 各组大鼠胃粘膜COX-1 mRNA的表达比较无明显差异(P＞0.05）。两个Ghrelin组大鼠胃粘膜COX-2 mRNA的表达明显低于NS组，差异具有统计学意义(P＜0.01，P＜0.05），并且呈剂量依赖性(见附表，图3-4）。

图3 各组大鼠胃粘膜COX-1 mRNA的表达

图4 各组大鼠胃粘膜COX-2 mRNA的表达

3 讨论

高浓度乙醇对胃粘膜的损伤机制是多方面的，包括脱水、蛋白凝固、溶解等作用，还可引起中性粒细胞浸润、刺激炎症因子分泌等。本实验研究发现，各组大鼠胃粘膜损伤程度存在显著差异，NS组大鼠胃粘膜严重坏死，为高浓度乙醇所致急性胃粘膜损伤的典型表现，0.5μg GH组大鼠胃粘膜损伤程度明显轻于NS组，部分粘膜存在坏死，5μg GH组大鼠胃粘膜仅见斑片状糜烂出血，粘膜基本完整;关于胃粘膜损伤指数的评估，0.5μg GH组和5μg GH组大鼠的胃粘膜损伤指数明显低于NS组;组织学观察也发现，两个Ghrelin组大鼠的胃粘膜结构排列较整齐，胃小凹和胃腺体损伤少，出血较NS组明显减轻，炎性细胞浸润也较NS组轻。表明外周予以Ghrelin能明显减轻乙醇诱导的急性胃粘膜损伤，保护胃粘膜结构的完整性，减少出血，具有较好的胃粘膜保护作用，同时可减少炎性反应，并且这种保护作用呈量效关系。

前列腺素是保护和修复胃粘膜完整性的重要因子，也是重要的炎症因子。环氧化酶是催化前列腺素的限速酶，有2个亚型:COX-1和COX-2。其中COX-1在大多组织中的表达比较稳定，属于“结构酶”，可维持胃肠道、肾脏的血流稳定，对胃粘膜起到保护和修复作用;COX-2在胃肠道一般为诱导酶，其产物前列腺素及血栓素A2(TXA2)与炎症反应有关[9]。通过荧光半定量PCR法检测，本研究发现，各组大鼠胃粘膜COX-1 mRNA的表达基本稳定，无明显差异，表明COX-1的表达不受乙醇和Ghrelin的影响。但各组大鼠胃粘膜COX-2 mRNA的表达存在显著差异，NS组大鼠胃粘膜COX-2 mRNA的表达明显高于空白对照组，表明乙醇可刺激胃粘膜COX-2的过度表达，通过产生大量前列腺素、TXA2导致胃粘膜水肿、炎性细胞聚集;两个Ghrelin组大鼠胃粘膜COX-2 mRNA的表达均明显低于NS组，并且降低程度呈量效关系，表明Ghrelin可抑制乙醇刺激的COX-2的高表达，通过减轻炎症反应保护胃粘膜。

各种理化、药物、应激导致的急性胃粘膜出血是上消化道出血的常见原因，Ghrelin对胃粘膜的保护作用可能会成为治疗急性胃粘膜损伤的一种有效方法，值得进一步深入探讨。

[1]Kojima M,Hosoda H,Date Y,et al.Ghrelin a growth-hormonereleasing acylated peptide from stomach[J].Nature,1999,402(6762):656-660.

[2]Hosda H, Kojima M, Matsuo H,et al.Ghrelin and desacylghrelin:two major forms of rat ghrelin peptide in gastrointestinal tissue[J].Biochem Bio phys Res Commun, 2000, 279(3):909-913.

[3]Hosoda H, Kojima M, Mizushima T, et a1.Structural divergence of human ghrelin:Identification of multiple ghrelinderived molecules produced by post-translational processing[J].Biol Chem, 2003,278(1): 64-70.

[4]Dornonville de la Cour C,M, Sandvik AK, et al.A-like cells in the rat stomach contain ghrelin and do not operate under gastrin control[J].Regul Pept, 2001, 99(2-3): 141-150.

[5]Levin F, Edholm T, Ehrstrom M, et al.Effect of peripherally administered ghrelin on gastric emptying and acid secretion in the rat[J].Regul Pept, 2005, 131(1-3): 59-65

[6]Sibilia V, Rindi G, Pagani F, et al.Ghrelin protects against ethanol-induced gastric ulcers in rats: studies on the mechanisms of action[J].Endocrinology, 2003,144(1):353-359.

[7]Crofford L.COX-1 and COX-2 tissue expression: implications and predictions[J].J Rheumato Suppl, 1997, 24: 15-19.

[8]徐叔云，卞如濂，陈修.药理实验方法学[M].第1版.北京:人民卫生出版社，1991.1158-1162.

[9]Sawaoka H,Tsuji S,Tsujii M,et al.Expression of the cyclooxygenase-2 gene in gastric epithelium[J].J Clin Gastroenterol, 1997, 25(Suppl 1):S105-S110.