多维分离策略分离半枝莲中野黄芩苷的实验研究

王立恒，迟晓飞，彭金咏，齐 艳，许丽娜，尹连红，韩 旭，许有威，赵艳艳

(1.大连市第二人民医院 康复中心，辽宁 大连 116011; 2.大连医科大学 药学院, 辽宁 大连 116044)

中药半枝莲别名金挖耳、狭叶韩信草、并头草等，为唇形科黄芩属植物半枝莲Scutellaria barata D. Don的干燥全草[1]。临床多用于治疗肝癌、胃癌、肺癌等疾病，主要有效成分是黄酮类化合物[2-4]。野黄芩苷是半枝莲中一种含量较高的活性物质，其含量高低与对肿瘤细胞的抑制作用呈正相关[5]，对脐静脉血管内皮细胞形成有促进作用[6]，另外能够影响到神经系统[7], 因此具有较高的研究价值。然而传统野黄芩苷的分离制备方法主要为反复柱层析，制备方法较繁琐，操作时间太长，重复性较差。有必要开发一种适合野黄芩苷制备的高效分离制备方法。

本研究采用多维分离策略对半枝莲中野黄芩苷进行分离。半枝莲粗提物先后经过大孔树脂法，有机溶剂萃取法，以及高速逆流色谱法(high speed counter-current chromatography, HSCCC)在较优的分离条件下进行分离，并采用高效液相色谱法分析，质谱仪鉴定所分离化合物的结构。这种多维分离策略兼具高效、便捷的优势，将为高效稳定获取半枝莲中野黄芩苷奠定理论和实践基础。

1 材料和方法

1.1 仪器和试剂

TBE-300A高速逆流色谱仪，TBP-50A恒压恒流微量泵(同田生化技术，上海)、8823-B紫外检测仪(新技术应用研究所，北京)、HX-1050恒温循环器(博医康实验仪器，北京)、N2000色谱数据工作站(浙江大学智达信息工程，浙江)。

Agilent 1200 HPLC包括在线真空脱气机、四元泵、自动进样器、紫外检测器、Chemstation 工作站(Agilent,USA)。

API 3200三重四级杆液相色谱-质谱联用仪(Applied Biosystems, USA)配置有电喷雾离子源(ESI)。

半枝莲药材(千草源有限公司，云南)经鉴定为唇形科黄芩属植物半枝莲Scutellaria barata D. Don的干燥全草。野黄芩苷标准品购自中国药品生物制品检定所(编号为880-200001)。

甲醇、正丁醇、乙酸乙酯均为分析纯试剂(科密欧，天津)；95%医用乙醇(天源药业，盘锦)；乙腈为色谱纯试剂(TEDIA, USA)；双蒸水由Milli-Q (Millipore, USA) 制备得到；D101大孔树脂(天津农药厂，天津)；C18色谱柱(5 μm, 4.6×250 mm, 华谱新创科技，北京)

1.2 高效液相色谱分析条件

仪器：Agilent 1200 HPLC；色谱柱：C18；流动相：乙腈(A)，水(B)；流速：1 mL/min；检测波长：280 nm；进样体积：15 μL；梯度条件：5%A-20 min-30%A-15 min-50%A。

1.3 质谱分析条件

负离子模式下，将样品的甲醇溶液(1000 ng/mL)以恒定流速10 μL/min的速度泵入质谱仪中，氮气压力为50 psi，电喷雾电压和温度分别为5500 V和700℃。氮气作为气帘气和碰撞气的压力分别设为12 psi和6 psi，去簇电压和入口电压分别设为50 V和5 V。碰撞能设为20 V，锥孔电压为35 V。

1.4 半枝莲的提取和分离过程

半枝莲粗提物制备方法：半枝莲生药材1000 g用70%的乙醇水溶液(料液比为1∶8，w/v)回流提取2次，3 h/次。两次提取液经过滤后合并，60℃减压回收溶剂真空干燥后得到棕黄色粉末，密封储存。

大孔树脂分离方法：半枝莲粗提物(50 g)用少量纯水溶解，上样于活化后的D101型大孔树脂进行分离，分别用纯水、20%乙醇水溶液、70%乙醇水溶液进行梯度洗脱，将所得的洗脱液各个组分浓缩成干燥粉末并称重。其中20%乙醇水溶液洗脱组分命名为样品A。

有机溶剂萃取分离方法：称取样品A (1.0 g)，采用正丁醇∶乙酸乙酯∶水(1∶1∶2，v/v/v)的液相体系(100 mL)进行有机溶剂萃取，分取有机相和水相减压挥去溶剂并真空干燥至粉末，用15%乙腈/水溶液溶解分别进行HPLC分析。其中有机溶剂萃取的水相命名为样品B。

HSCCC分离方法：正丁醇-水(1∶1，v/v)系统在室温下静置过夜分层，上相为固定相，下相为流动相。以10 mL/min流速将固定相泵入HSCCC中，待分离管中充满固定相后，开启主机，设定主机转速为800 rpm，以1.5 mL/min流速泵入流动相，紫外检测波长为280 nm，温度设定为25℃。称取样品B (100 mg)，用20 mL分离初始条件溶液溶解，作为待分离样品溶液，采用HSCCC分离出3个组分，分别为保留时间 113～168 min、168～235 min、固定液；所接的组分中各取出1.5 mL挥去溶剂后溶解于1 mL超纯水中备用。

2 结 果

2.1 大孔树脂分离方法

经过大孔树脂分离后发现20%乙醇水洗脱物中固形物成分含量较高，固定物质量占上样量比例为18.4%，半枝莲中野黄芩苷主要存在于该组分中，具有较大的研究潜力，因此选择20%乙醇水洗脱物(样品A)作为后续分离制备的研究对象。

2.2 有机溶剂萃取法

经过有机溶剂萃取后，采用HPLC对样品A在有机相和水相中分离情况进行了考察，结果如图1所示：有机溶剂萃取后水相化学组分成分较单一，主成分含量较高，适合在优化的条件下进行HSCCC继续分离制备。因此选择有机溶剂萃取的水层(样品B)作为HSCCC分离对象。

2.3 高速逆流色谱法

对于极性较大的样品B来说，采用HSCCC进行分离，主要从极性洗脱体系进行优化，应用HSCCC分离样品B后，固定液组分的HPLC色谱图谱如图2所示。

2.4 野黄芩苷结构鉴定

在较优的质谱条件下，对HSCCC分离得到的主成分进行了定性，质谱图如图3所示。

图1 有机溶剂萃取法分离各组分的色谱图谱

图2 HSCCC分离后组分HPLC图谱

图3 主成分的一级质谱图(A)和以284.9为母离子的二级质谱图(B)Fig 3 MS1 (A) and MS2 (B) mass spectrum of the main peak

一级质谱图中460.7为分子离子峰，为半枝莲中主要有效成分野黄芩苷的分子离子峰，其中284.9为野黄芩苷元的碎片峰。以分子量284.9为母离子进行二级质谱分析后，发现主要断裂碎片与王艳萍等[8-9]报道野黄芩苷元碎片断裂规律基本一致。

另外，通过在相同高效液相色谱条件下与野黄芩苷标准品的色谱保留情况相对照，能够进一步确定所分离的主成分为野黄芩苷。

3 讨 论

本研究所开发的多维分离策略不仅能够高效、高纯度地获得半枝莲中的有效成分，而且具有分离流程短，目标明确的特点。在大孔树脂粗分离和有机溶剂萃取后，半枝莲中野黄芩苷的成分得到较好富集，采用高速逆流色谱进一步分离后，野黄芩苷的纯度得到较大的提高，这显示出多维分离方法在分离制备半枝莲中有效物质的优势。未见有采用这种多维分离策略分离半枝莲中的野黄芩苷物质的文献报道。

在主成分结构鉴定过程中，首先采用质谱法初步推测化合物结构，根据一级质谱和二级质谱的碎片特征，并结合文献报道，推测出所制备的主成分是在半枝莲生药材中含量较高的野黄芩苷；然后采用高效液相色谱法将主成分峰与野黄芩苷标准品的保留行为进行对照，结果进一步确定该成分结构为野黄芩苷。

本研究能够为从半枝莲中制备高纯度野黄芩苷活性成分奠定基础，所发展的方法能够对从天然植物中分离制备活性化合物提供有意义的借鉴。

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