不动杆菌外膜蛋白的研究进展

周万青，沈 瀚

（南京大学医学院附属鼓楼医院 检 验科，江苏 南 京210008）

不动杆菌是一种重要的条件致病菌，是引起院内感染的常见病原菌。可导致广泛的临床感染，例如败血症、泌尿系感染、伤口感染、脑膜炎等，特别是院内机械通气相关性肺炎［1］。近年来，随着广谱抗生素的大量应用，多重耐药株和泛耐株日益增多，给临床治疗带来严峻挑战。不动杆菌的耐药机制比较复杂，主要有以下几种：灭活酶的产生，外膜蛋白的减少、缺失或突变，药物的主动外排机制，药物作用靶位如青霉素结合蛋白改变等［1］。耐药菌株一般合并存在几种耐药机制，一些可移动元件如整合子的参与使得其耐药性具有可传递性。其中外膜蛋白（outer membrane proteins，OMP）的改变所介导的抗生素耐药越发引起人们的重视。本文就不动杆菌外膜蛋白改变所介导的抗生素耐药研究现状作一综述。

1 细菌外膜结构及通透特性

细菌外膜是环绕革兰阴性菌细胞壁的一种特征性脂质双分子层结构，外层是脂多糖，具有非常有效的通透屏障作用；内层是磷脂。外膜屏障功能的改变介导的耐药包括外膜通透性的降低和主动外排两种机制。外膜孔蛋白（porins）穿透外膜的内外双层，构成跨膜的扩散通道。膜孔蛋白通道非常狭窄，对大分子及疏水性化合物的穿透形成有效屏障，只允许亲水性小分子通过以进行细胞内外的物质运输及交换。如果这些通道发生缺失或改变，抗生素将不能进入细菌到达作用靶位，从而使得细菌产生耐药性。不动杆菌的外膜通透性极低，仅为大肠埃希菌的1%－3%，这是其对多种抗生素天然耐药的重要原因之一。与铜绿假单胞菌相比，对于头孢菌素类药物的通透系数要低2－7倍［1］。

抗生素通过两种外膜通道进入细菌：亲水性抗生素的孔蛋白通道和疏水性抗生素的脂质介导通道［2］。小的亲水性药物如β－内酰胺类、氯霉素通过亲水性孔蛋白通道进入细菌；而大环内酯类和其他疏水性药物（氨基糖苷类、利福霉素类、新生霉素、夫西地酸、阳离子肽类）则通过脂质层扩散进入细菌；四环素类和喹诺酮类则可通过两种通道进入细菌内部，主要取决于药物的质子化程度［2］。

研究发现，除了荚膜多糖转座子外，所有的外膜蛋白都是β桶状拓扑结构［2］。大量的β链条折叠构象形成一个亲水性的中心孔道。革兰阴性细菌孔蛋白的典型结构特点：高离子强度，缺乏疏水残基，低离子选择性，低的不稳定指数，较高的甘氨酸成分并缺乏半胱氨酸残基［1］。渗透压和温度可影响外膜蛋白的表达［3］。除了在数量表达上或是突变所造成的外膜蛋白改变外，其他一些物化因素或配体的结合作用亦可通过改变外膜孔道的大小进而影响其对药物的通透性。例如跨膜电位，电压依赖性灭活是普遍的现象，当电位差达到该孔蛋白的关闭阈值时，则该孔道关闭［2］。另外在酸性环境和聚胺类物质存在时也可调节孔蛋白通道的开关［2］。最新研究表明，一价阳离子分别在转录水平和翻译后水平影响外膜蛋白的表达，并且增强外膜蛋白的释放，从而介导菌株的耐药［4］。

2 不动杆菌外膜孔蛋白

外膜孔蛋白是细菌进行内外环境物质交换的通道，也是药物进入菌内的通道，当外膜蛋白发生改变时，可影响药物的內渗率。一些革兰阴性杆菌的外膜孔蛋白已经得到了很好的研究，包括大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、鼠伤寒沙门菌、奇异变形杆菌等［2］。目前对不动杆菌外膜蛋白的了解不多，对其通透特性的研究更为之寥寥。不动杆菌外膜蛋白种类较少和孔蛋白较小分子量使得其通透性明显低于其他革兰阴性细菌［1］。对于介导β－内酰胺类抗生素进入细菌的外膜蛋白知之甚少。但是近年来，在不动杆菌中还是发现多种孔蛋白，如Car O蛋白［5－8］、热修饰蛋白（heat－modifiable protein，HMP－AB）［9］、外膜蛋白 W（Omp W）［10］、Opr D 样 蛋 白［11］、33－36 k Da蛋白［12，13］、外膜蛋白 A（Omp A）［14］等。碳青霉烯类耐药不动杆菌中主要发现三种外膜蛋白缺失，分别是Car O 蛋白、33－36k Da蛋白和 Opr D样蛋白［1］。

2.1 CarO蛋白

Limansky［5］通过SDS－PAGE 电泳分析亚胺培南（IPM）敏感和耐药的鲍曼不动杆菌外膜蛋白的差异，发现IPM耐药株存在29 k Da OMP缺失。由于在敏感株和耐药株均未检测到碳青霉烯酶，推测IPM抗性归于该外膜蛋白的缺失。由于水杨酸钠具有抑制特定OMP表达的功能，研究者随后用16 m M水杨酸钠处理IPM敏感株，发现IPM敏感株29 k Da OMP表达下降，而IPM的 MIC却从0.5 μg／ml上升到16μg／ml。通过体外诱导，Limansky从敏感菌中成功选择出了29 k Da OMP的缺失耐药突变体。

对该蛋白进一步研究表明其具有热修饰性，并命名为Car O蛋白［6］。从临床分离株中克隆到包含Car O基因的染色体位点后研究发现，该基因为单拷贝，编码247个氨基酸残基的多肽，该多肽具有典型的氨基末端信号序列，拓扑学结构为跨膜β－桶形。虽然Car O与铜绿假单胞菌中的Opr D无同源性，但二者均参与细菌对碱性氨基酸和亚胺培南的摄入［7］。37℃培养条件下Car O蛋白占总外膜蛋白的20%［6］，然而降低培养温度将降低这一含量水平［7］。另有研究发现NaCl或KCl亦可影响该蛋白的表达［4］。

当Car O编码基因中有插入序列时，会发生插入失活导致Car O基因不表达［6，15］。通过二维差异电泳技术发现Car O亚型的高表达使得外膜通透性减低而介导耐药［16］。由此推测其参与碳青霉烯类药物的流入过程。然而通过质谱研究发现，与Car O同时存在的另一25k Da蛋白，命名为Omp25［8］。这两种蛋白都具有典型的β－桶状构象，然而只有Car O具有孔形成特性。但是Car O中并未发现亚胺培南的结合位点，表明这是种非特异性的单体通道。该通道对阳离子的低选择性与铜绿假单胞菌中的Opr F和大肠埃希菌中的Omp A所形成的非特异孔蛋白特性相似［2］。

2.2 HMP－AB

鲍曼不动杆菌热修饰蛋白（HMP－AB）基因编码一个346氨基酸残基、分子量为35.6 k Da的蛋白，其以单体孔蛋白的形式组装在细菌外膜上。随着温度的变化，热修饰蛋白在SDS－PAGE电泳后呈现出不同的迁移特性［9］。序列比对研究发现，HMP－AB与肠杆菌科细菌外膜蛋白A（Omp A）以及铜绿假单胞菌外膜蛋白F（Opr F）具有同源性。虽然与不解糖卟啉单胞菌热修饰蛋白（HMP－PA）在分子活动度上相似，但二者具有不同的抗原性［1］。二级结构分析表明，HMP－AB氨基端由172个氨基酸残基组成，并形成8个两性的β链而贯穿外膜，C端作为锚定蛋白结合在肽聚糖层，属于Omp A样家族。这类孔蛋白以缓慢孔蛋白著称，其对β－内酰胺类和糖肽类药物的通透性依赖于药物的大小，最大允许800Da分子量的药物通过［9］。

2.3 Omp W

大肠埃希菌Omp W由8链β折叠单体组成，在脂质层平面上形成一个狭小的离子通道。研究发现该通道具有转运小分子疏水性物质的功能［10］。不动杆菌Omp W与大肠埃希菌和铜绿假单胞菌中的Omp W具有高度同源性。其在不动杆菌中的功能尚不清楚。然而，最新研究发现多粘菌素耐药突变株中该外膜蛋白呈低表达［1］。在耐头孢曲松鼠伤寒沙门菌中Omp W 亦呈明显低表达［10］，由此推测Omp W可能参与药物的摄取并介导耐药。

2.4 Opr D样蛋白

OprD是铜绿假单胞菌中的一种外膜孔蛋白，由18链β折叠单体组成。对铜绿假单胞菌碳青霉烯类耐药性研究发现，Opr D具有摄取碱性氨基酸、小分子短肽、亚胺培南和美罗培南功能［1］。Dupont等［11］在耐药鲍曼不动杆菌中同样发现了一43 k Da的外膜蛋白的丢失，随后的质谱分析表明这一43 k Da外膜蛋白与铜绿假单胞菌Opr D具有同源性，故又称 Opr D－like蛋白。因此，对于不动杆菌，Opr D样蛋白可能发挥碳青霉烯类特异性通道，而Car O则只是一种非特异性的孔道作用［11］。

2.5 33－36kDa蛋白

Clark［12］在1996年发现33－36 k Da外膜蛋白介导了鲍曼不动杆菌亚胺培南耐药。Tomás等［13］随后对该类蛋白氨基酸序列进行研究，发现其具有革兰阴性细菌外膜孔蛋白的典型特征。通过携带该基因的穿梭质粒进行补偿研究发现，该蛋白的补偿表达可恢复耐药株对碳青霉烯类药物的敏感性。

2.6 Omp A

38 k Da的外膜蛋白A（Omp A）在鲍曼、琼氏、耐放射性不动杆菌中具有较高的同源性［1］。但是作者并未对上述蛋白与 HMP－AB进行比较分析。Vashist等［17］研究发现鲍曼不动杆菌Omp A是具有转运小分子物质的跨膜孔蛋白。在对耐放射不动杆菌中Omp A蛋白的研究发现，其包裹在分泌囊泡中，在细菌的致病性、生物膜形成以及调节表面粘附中发挥作用［1］。同样在鲍曼不动杆菌中，Omp A作为毒力因子通过外膜囊泡的分泌诱导宿主细胞的死亡［14］。

2.7 其他蛋白

Quale等［18］发现碳青霉烯类耐药鲍曼不动杆菌中37－、44－、47－k Da外膜蛋白的低表达与 AmpC 酶的存在共同介导了耐药的发生。Bou等［19］发现，产OXA－24酶的耐药鲍曼不动杆菌存在22 k Da和33 k Da两种外膜蛋白的低表达。Felipe等［20］发现一22.5 k Da外膜蛋白缺失参与碳青霉烯类耐药。由此可见，外膜通透性降低合并β－内酰胺酶的存在可共同介导了高水平耐药。Luo等［21］研究发现Car O和Opr D样蛋白的下调合并34 k Da外排泵的上调表达可造成碳青霉烯类耐药。生理浓度水平的NaCl或KCl可造成鲍曼不动杆菌对氨基糖苷类、碳青霉烯类、喹诺酮类以及粘菌素类药物的耐受性。其主要通过减少Car O和33－36 k Da蛋白的表达并促进以上两种外膜蛋白的释放，以及上调外排泵水平实现［4］。Yun等［22］对一株多重耐药鲍曼不动杆菌进行亚最小抑菌浓度的四环素作用后发现，该菌株出现Omp A38、Omp A32、Car O以及Omp W蛋白的表达下调。

3 结语

不动杆菌可造成院内免疫低下患者的大范围流行，其可通过接触污染物或暴露的环境在患者之间进行传播。近年来，β－内酰胺类药物特别是碳青霉烯类药物的大量及不合理应用，造成多重耐药鲍曼不动杆菌的检出率逐年提高［23］。耐药性的产生可由一种或几种机制共同导致。外膜蛋白的减少、缺失或突变在不动杆菌碳青霉烯类耐药过程中发挥重要作用。对于外膜蛋白参与其他药物耐药的机制还不清楚，是否存在对特定药物的特异通道蛋白尚待研究。随着研究的不断深入，有更多的外膜蛋白被发现［24］，其在介导耐药中的具体机制也将被逐个探明。最新研究发现鲍曼不动杆菌外膜蛋白具有免疫诊断价值［25，26］。由此可见，对不动杆菌外膜蛋白的深入研究，将会为临床多重耐药不动杆菌感染的早期免疫诊断和新型抗外膜蛋白药物的研制提供依据。

［1］Vila J，MartíS and Sánchez－Céspedes J.Porins，efflux pumps and multidrug resistance in Acinetobacter baumannii［J］.J Antimicrob Chemother，2007，59（6）：1210.

［2］Delcour AH.Outer membrane permeability and antibiotic resistance［J］.Biochim Biophys Acta，2009，1794（5）：808.

［3］Jyothisri K，Deepak V and Rajeswari MR.Purification and characterization of a major 40 k Da outer membrane protein of Acinetobacter baumannii［J］.FEBS Lett，1999，443（1）：57.

［4］Hood Mi，Jacobs AC，Sayood K，et al.Acinetobacter baumannii increases tolerance to antibiotics in response to monovalent cations［J］.Antimicrob Agents Chemother，2010，54（3）：1029.

［5］Limansky AS，Mussi MA and Viale AM.Loss of a 29－kilodalton outer membrane protein in Acinetobacter baumannii is associated with imipenem resistance［J］.J Clin Microbiol，2002，40（12）：4776.

［6］Mussi MA，Limansky AS and Viale AM.Acquisition of resistance to carbapenems in multidrug－resistant clinical strains of Acinetobacter baumannii：natural insertional inactivation of a gene enco－ding a member of a novel family of beta－barrel outer membrane proteins［J］.Antimicrobiob Agents Chemother，2005，49（4）：1432.

［7］Mussi MA，Relling VM，Limansky AS，et al.Car O，an Acinetobacter baumannii outer membrane protein involved in carbapenem resistance，is essential for L－ornithine uptake［J］.FEBS Lett，2007，581（29）：5573.

［8］Siroy A，Molle V，Lemaâtre－Guillier C，et al.Channel formation by Car O，the carbapenem resistance－associated outer membrane protein of Acinetobacter baumannii［J］.Antimicrobiob Agents Chemother，2005，49（12）：4876.

［9］Gribun A，Nitzan Y，Pechatnikov I，et al.Molecular and structural characterization of the HMP－AB gene encoding a pore－forming protein from a clinical isolate of Acinetobacter baumannii［J］.Curr Microbiol，2003，47（5）：434.

［10］Hong H，Patel DR，Tamm LK，et al.The outer membrane protein Omp W forms an eight－strandedβ－barrel with a hydrophobic channel［J］.J Biol Chem，2006，281（11）：7568.

［11］Dupont M，Pages JM，Lafitte D，et al.Identification of an Opr D homologue in Acinetobacter baumannii［J］.J Proteme Res，2005，4（6）：2386.

［12］Clark RB.Imipenem resistance among Acinetobacter baumannii：association with reduced expression of a 33－36 k Da outer membrane protein［J］.J Antimicrob Chem，1996，38（2）：245.

［13］del Mar Tomás M，Beceiro A，Pérez A，et al.Cloning and functional analysis of the gene encoding the 33－to 36－kilodalton outer membrane protein associated with carbapenem resistance in Acinetobacter baumannii［J］.Antimicrobiob Agents Chemother，2005，49（12）：5172.

［14］Jin JS，Kwon SO，Moon DC，et al.Acinetobacter baumannii secretes cytotoxic outer membrane protein A via outer membrane vesicles［J］.PLoS One，2011，28；6（2）：e17027.

［15］Lee Y，Kim CK，Lee H，et al.Anovel insertion sequence，ISA－ba10，inserted into ISAba1 adjacent to the bla（OXA－23）gene and disrupting the outer membrane protein gene car O in Acinetobacter baumannii［J］.Antimicrobiob Agents Chemother，2011，55（1）：361.

［16］Vashist J，Tiwari V，Kapil A，et al.Quantitative profiling and identification of outer membrane proteins ofβ－lactam resistant strain of Acinetobacter baumannii［J］.J Proteome Res，2010，9（2）：1121.

［17］Vashist J，Rajeswari MR.Structural investigations on novel porin，Omp Ab from Acinetobacter baumannii［J］.J Biomol Struct Dyn，2006，24（3）：243.

［18］Quale J，Bratu S，Landman D，et al.Molecular epidemiology and mechanisms of carbapenem resistance in Acinetobacter baumannii endemic in New York City［J］.Clin Infect Dis，2003，37（2）：214.

［19］Bou G，CerveróG，Domínguez MA，et al.Characterization of a nosocomial outbreak caused by a multiresistant Acinetobacter baumannii strain with a carbapenem－hydrolyzing enzyme：highlevel carbapenem resistance in A.baumannii is not due solely to the presence ofβ－lactamases［J］.J Clin Microbiol，2000，38（9）：3299.

［20］Fernández－Cuenca F，Martínez－Martínez L，Conejo MC，et al.Relationship between beta－lactamase production，outer membrane protein and penicillin－binding protein profiles on the activity of carbapenems against clinical isolates of Acinetobacter baumannii［J］.J Antimicrob Chemother，2003，51（3）：565.

［21］Luo L，Jiang X，Wu Q，et al.Efflux pump overexpression in conjunction with alternation of outer membrane protein may induce Acinetobacter baumannii resistant to imipenem［J］.Chemotherapy，2011，57（1）：77.

［22］Yun SH，Choi CW，Park SH，et al.Proteomic analysis of outer membrane proteins from Acinetobacter baumannii DU202 in tetracycline stress condition［J］.J Microbiol，2008，46（6）：720.

［23］蒯守刚，邵海枫.不动杆菌耐药机制研究进展［J］.中国实验诊断学，2009，13（2）：278.

［24］Yun SH，Choi CW，Kwon SO，et al.Quantitative proteomic analysis of cell wall and plasma membrane fractions from multidrugresistant Acinetobacter baumannii［J］.J Proteome Res，2011，10（2）：459.

［25］Islam AH，Singh KK，Ismail A.Demonstration of an outer membrane protein that is antigenically specific for Acinetobacter baumannii［J］.Diagn Microbiol Infect Dis，2011，69（1）：38.

［26］McConnell MJ，Domínguez－Herrera J，Smani Y，et al.Vaccination with outer membrane complexes elicits rapid protective immunity to multidrug－resistant Acinetobacter baumannii［J］.Infect Immum，2011，79（1）：518.