注射用血凝酶体内外止血作用的研究

王兆钺(苏州大学附属第一医院，江苏省血液研究所，卫生部血栓与止血重点实验室，江苏苏州 215006)

出血在临床上相当常见，约占血液病门诊的1/3，除血液科外，临床各科也都有出血问题。引起出血的最主要原因为血小板量或质的异常和凝血障碍，先天性或获得性血管异常、纤溶亢进以及循环中抗凝物质增多等因素也可导致出血。在有严重出血时，需要给予止血药帮助止血。临床上有效的止血药不多，并且都有一定的局限性。维生素K只对维生素K依赖性凝血因子减少的出血有效。去氨加压素(DDAVP，弥凝)对1型血管性血友病(vWD)有良好的治疗效果，亦可作为轻、中症血友病的首选药物。抗纤溶药(氨甲苯酸与氨甲环酸等)抑制纤维蛋白的水解，主要用于手术创伤、体外循环、肝脏疾病或肿瘤等引起的纤溶亢进或原发性纤溶活性过强所引起的出血;适用于伴有纤溶亢进的出血。重组的因子Ⅶa的适应证为有抑制物的血友病A与血友病B与先天性因子Ⅶ缺乏，对严重的血小板病与严重肝脏疾病也有较好的效果［1］;但价格昂贵，半衰期短。其他止血药，如卡络磺钠与止血敏等缺乏大规模的临床验证，其确切效果难以肯定。临床上需要有广谱、安全可靠的止血药。

注射用血凝酶(巴曲亭)为巴西矛头蝮蛇(bothrops atrox)毒液中分离出来的止血成份，包括2种有效成分:巴曲酶及少量凝血因子Ⅹ激活物(FⅩA)。巴曲酶直接作用于纤维蛋白原Aα链Arg16-Gly17处，释放纤维蛋白肽A后形成纤维蛋白单体Ⅰ，但不降解纤维蛋白B肽，亦不直接激活FⅩⅢ，因此不能形成稳定的纤维蛋白。FⅩA可以直接激活FⅩ，从而激活凝血酶原，使纤维蛋白原降解成纤维蛋白，并激活FⅩⅢ，形成稳定的纤维蛋白。注射用血凝酶已广泛用于神经外科、妇科与骨科手术以及消化道与呼吸道出血，临床上有较满意的止血效果［2，3］，我们对其体内外止血作用进行了较完整研究。

1 注射用血凝酶及其有效成分对凝血的影响

活化的部分凝血活酶时间(aPTT)反映了内源性凝血系统的活性;而凝血酶原时间(PT)反映了外源性凝血系统的活性。FⅩA、巴曲酶及注射用血凝酶均能缩短正常人血浆的aPTT;随着浓度的增大，缩短aPTT的作用越明显，其中FⅩA的作用在一定剂量范围内存在量效关系(r=0.889，P＜0.05)。当FⅩA浓度为0.000 5 U·mL-1、巴曲酶及注射用血凝酶在浓度为0.05 U·mL-1时，可使正常人血浆的APTT缩短10 s左右，这表明注射用血凝酶及其有效成分可以促进血浆的凝血过程。但FⅩA、巴曲酶及注射用血凝酶都对凝血酶原时间(PT)无明显影响。这是由于检测PT的试剂中含有一定量的肝素，而注射用血凝酶及其有效成份不能拮抗肝素的抗凝作用。

2 注射用血凝酶及其有效成分对出血性疾病止血异常的作用

各种凝血疾病的病理机制不同。血友病A为缺乏凝血因子Ⅷ，血友病B为缺乏凝血因子Ⅸ，维生素K依赖性凝血因子缺乏症为凝血酶原、因子Ⅶ、Ⅸ与Ⅹ减少，vWD为 von Willebrand因子量的缺乏或质的异常。我们在实验中发现，当FⅩA浓度＞0.000 5 U·mL-1、巴曲酶及注射用血凝酶浓度＞0.05 U·mL-1时，可完全纠正血友病A患者血浆aPTT的延长。因此在出血性疾病的实验研究中选用以上的FXA、巴曲酶与注射用血凝酶浓度。注射用血凝酶及其有效成分可完全纠正血友病A、血友病B、维生素K依赖性凝血因子缺乏症、FⅤ缺乏症与vWD患者血浆aPTT的延长，对FⅩ缺乏症患者aPTT的延长也能明显缩短(P＜0.001)，而对无纤维蛋白原血症患者血浆的aPTT无明显影响。这些体外实验结果提示注射用血凝酶及其有效成分能纠正除无纤维蛋白原血症以外的凝血疾病的止血缺陷。但FⅩA、巴曲酶及注射用血凝酶不能纠正FⅤ、FⅦ、FⅩ缺乏症、维生素K依赖性凝血因子缺乏症患者与无纤维蛋白原血症患者PT的延长。

3 注射用血凝酶及其有效成分对FⅩ活化的影响

FⅩA可以活化纯化的FⅩ或正常人血浆中的FⅩ，且随着FⅩA浓度的增加，FⅩa的浓度也相应升高(r=0.889，P＜0.05)，但由于仍有少量的FⅩ尚未被完全活化，FⅩa的浓度低于FⅩ的浓度。对部分出血性疾病，如血友病A、血友病B与VWD患者，FⅩA可明显使其血浆中的FⅩ活化;而FⅩ缺乏症患者及维生素K依赖性凝血因子缺乏症患者血浆由于缺乏FⅩ，FⅩa升高不明显。巴曲酶不作用于FⅩ;而注射用血凝酶中仅含有少量FⅩA，尚不足以激活FⅩ。

4 注射用血凝酶及其有效成分对凝血酶生成的影响

FX是凝血酶原酶的最主要成分，活化后使凝血酶原转变为凝血酶，后者将纤维蛋白原转变为纤维蛋白，导致了血液的凝固。FⅩA可明显促进正常人血浆中凝血酶的生成，但与FⅩA浓度无明显线性相关关系。对血友病A、血友病B、vWD、FⅩ缺乏症患者及维生素K依赖性凝血因子缺乏症患者亦能明显促进其凝血酶生成(P＜0.005)。但巴曲酶及注射用血凝酶对正常人血浆及出血性疾病患者的凝血酶生成作用不明显。巴曲酶不作用凝血酶原;而注射用血凝酶中少量的FⅩA，尚不足以激活FⅩ与凝血酶原，主要依靠巴曲酶发挥止血作用，因此低剂量的FⅩA仅具有加强止血的效果。

5 注射用血凝酶及其有效成分对纤维蛋白形成及纤溶系统的影响

注射用血凝酶与巴曲酶均可水解纤维蛋白原A肽，在0.05 U·mL-1浓度时使血浆纤维蛋白原A肽水平增加60倍;FⅩA通过激活FⅩ与凝血酶原水解纤维蛋白原A肽与B肽，在0.000 5 U·mL-1浓度时能使血浆纤维蛋白原A肽水平增加90倍。电子显微镜检查发现，凝血酶与FⅩA形成的纤维蛋白丝粗大紧密，而注射用血凝酶与巴曲酶形成的纤维蛋白丝纤细疏松，后者在纤维蛋白溶解实验中很快被溶解。这说明注射用血凝酶由于只水解纤维蛋白原A肽，形成的止血块很不牢固，易被水解清除［4］。这是临床运用注射用血凝酶止血过程中不易发生血栓的一个主要原因。

6 注射用血凝酶对肝素抗凝血作用的影响

肝素是一种主要的抗凝血药，起着抗凝血酶的辅因子作用。临床上在经皮冠状动脉腔内血管成形术(PTCA)或安置支架时常规给予肝素抗凝，但有引起出血的风险。低分子量肝素(LMWH)对凝血酶的抑制作用较弱，但保留了抗活化的因子Ⅹ的作用。我们研究了FⅩA是否有拮抗肝素的作用，选用0.000 1～0.005 U·mL-1不同浓度的FⅩA，但FⅩA仅在高浓度(0.000 5 U·mL-1)时有轻度中和作用，增加FⅩA深度不影响肝素的抗活化FⅩ的活性。这是由于肝素对凝血酶与因子Ⅹa等丝氨酸蛋白酶的抑制作用只起催化作用，抑制完成后可解脱下来，再催化下一个活化的凝血因子，肝素本身不被消耗。因此不管FⅩA的浓度是多少，都不能影响肝素的催化活性。同样，不同浓度的FⅩA对LMWH的中和作用也不明显;改用仅含有5个糖单位的磺达肝素钠亦显示类似的结果。但这些结果只说明FⅩA不拮抗肝素的抗凝作用，注射用血凝酶中最主要成分是巴曲酶，后者仍有可能减轻手术时运用肝素的出血风险。

7 注射用血凝酶及其有效成分对血小板聚集的影响

各种浓度的FⅩA、巴曲酶及注射用血凝酶都不引起血小板聚集，对ADP、花生四烯酸与瑞斯托霉素等多种诱导剂引起的血小板聚集也无影响，因此注射用血凝酶及其有效成分不能直接活化血小板。

8 注射用血凝酶对临床出血性疾病的止血作用

在体外实验的基础上，我们试用注射用血凝酶治疗血友病A与先天性因子Ⅶ缺乏症，实验室检查显示凝血指标轻度改善，但出血未能控制。获得性血友病A是一严重出血性疾病，由于患者体内存在抗因子Ⅷ自身抗体，输注因子Ⅷ无效。我们试用注射用血凝酶治疗2例获得性血友病A性疾病患者，实验室检查示aPTT轻度缩短，加用凝血酶原复合物以及免疫抑制剂等综合治疗后出血最后完全停止。初步结果表明，注射用血凝酶可做为获得性血友病A的一种辅助治疗药物。但我们发现给与大剂量注射用血凝酶(8 U·d-1)并延长给药时间(5 d)可能因纤维蛋白原过多降解会导致血浆纤维蛋白原水平的降低。

我们的研究工作证实了注射用血凝酶的止血效果，并首次观察到注射用血凝酶可纠正多种出血性疾病的止血异常。这项研究表明:(1)注射用血凝酶体外局部止血有肯定的效果;(2)注射用血凝酶中的巴曲酶在止血中起了主要作用，FXA含量很低，只起次要作用;(3)注射用血凝酶引起的纤维蛋白凝块易被分解，维持时间较短，因此常规剂量的注射用血凝酶无致血栓危险;但如连续大量给药数天后可能使血浆纤维蛋白原降低;(4)注射用血凝酶可作为多数出血性疾病止血的辅助药物，但不适用于无(低)纤维蛋白原血症、DIC或纤维蛋白溶解亢进;(5)较长时间使用大剂量注射用血凝酶可能导致血浆纤维蛋白原水平，推荐在临床上短期应用常规剂量。

［1］ de Paula EV，Kavakli K，Mahlangu J，et al.Recombinant factor VIIa analog(vatreptacog alfa［activated］)for treatment of joint bleeds in hemophilia patients with inhibitors:a randomized controlled trial［J］.J Thromb Haemost，2012，10(1):81.

［2］ 卢海武，林少芒，邵子力，等.巴曲亭——蛇毒凝血酶在普通外科手术中的应用研究［J］.血栓与止血学杂志，2003，9(1):18.

［3］ 韦 帆，廖 阳.血凝酶的临床应用进展［J］.临床合理用药，2009，2(19):114.

［4］ Magalhaes HP，Magalhaes A，Juliano L，et al.Mechnism of action and detem-lination of the best substrate for a thrombin-like enzyme from Lacchesis muta muta venom by regression analysis of the kinetic parameters determined with peptidyl p-nitroanilide substrates［J］.Toxicon，2006，47(4):453.