Annexin A2基因沉默对肺癌细胞转移能力的影响①

高 昕 王述民 曲家骐 刘 博 (沈阳军区总医院胸外科，沈阳110016)

Annexin家族是一类钙依赖性膜磷脂结合蛋白，参与膜转运及膜表面一系列依赖于钙调蛋白的活动，包括钙离子通道的形成、调控炎症反应、纤溶、胞吐、胞吞、细胞增殖、DNA修复合成、细胞分化与凋亡、细胞骨架活动、成骨细胞的形成和骨的重吸收、膜功能区的形成、信号转导等［1］。广泛存在于核内、胞质、细胞质膜下、储Ca2+细胞器附近及细胞外基质中，约占细胞总蛋白的2%。Annexin A2是家族中的一个重要成员，在肿瘤的侵袭转移中发挥重要作用［2，3］。本研究拟探讨 Annexin A2基因沉默对肺癌细胞转移能力的影响，进一步明确肺癌转移中相关分子机制，以期为肺癌的基因治疗提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料 DMEM及1640培养基购于美国Gibco公司。胎牛血清购于四季青生物工程有限公司。逆转录、rTaq DNA聚合酶、dNTP、限制性核酸内切酶和DL2000试剂购于日本TaKaRa公司。质粒抽提试剂盒购于美国Axygen公司。Trizol及LipofectamineTM2000购于美国Invotrigen公司。单克隆鼠抗人Annexin A2抗体购于美国Diagnostica公司。生物素化的兔抗鼠IgG购于美国Sigma公司。A549，SPC-1-A，95D和95C肺癌细胞由本院呼吸实验室室保存。真核细胞载体psilencer-Annexin A2由哈尔滨医科大学黄昀博士惠赠。抗磷酸化的mTOR多克隆抗体购自Cell Signaling Technology公司;抗β-actin单克隆抗体购于晶美生物工程有限公司;HRP标记二抗体和FITC标记二抗购于北京中山公司;ECL化学发光试剂盒购于美国Amersham公司;Transwell小室购于丹麦Costar Corning公司;瑞士姬姆萨染色液购于珠海贝索生物技术有限公司。

1.2方法

1.2.1细胞系的培养 A549、95D、SPC-1-A和95C共4种肺腺癌细胞系均用含10%胎牛血清、1%双抗和1.5%谷胺酰胺的RPMI1640培养基培养，在37℃、5%CO2的细胞培养箱中培养，每2～3天传代1次。

1.2.2明胶酶活性分析 应用金属蛋白酶活性分析实验进行体外培养细胞转移能力分析。按1×104个细胞/每孔接种肺腺癌细胞于24孔培养板内。细胞贴壁后，弃去培养液，换成无血清RPMI1640培养基。培养24小时后，收集培养上清液，1 000 r/min，离心10分钟，取上清液分装，-20℃冻存。配制10%SDS-PAGE胶(含1%明胶)，作为分离胶，上层为6%的积层胶，以15 μl的细胞培养上清液上样，150 V恒压电泳1小时后，取出凝胶放入2.5%Triton-X100溶液中浸泡2小时，然后在明胶酶缓冲液(50 mmol/L Tris-HCl，200 mmol/L NaCl，10 mmol/L CaCl2，pH7.5)中37℃孵育18小时，考马斯亮蓝染色，透射扫描仪扫描并存贮图像，Bio-Rad凝胶成像软件分析蛋白负染情况。

1.2.3Transwell细胞迁移实验 弃去细胞培养基，PBS冲洗细胞2次，胰酶消化5分钟，离心，弃上清，10%FCS的DMEM重悬细胞，反复吹打均匀，光镜下用计数板进行细胞计数，取5×104个细胞于24孔板中的 Transwell(小孔内径8 μm)上室，取500 μl含10%FCS的DMEM于Transwell下室，将含Transwell小室的24孔板置于37℃、含5%CO2的细胞培养箱中，6小时后取出，用棉签擦去小室滤膜上层细胞，移行并粘附到滤膜下层面的细胞以瑞士姬姆萨染色液染色3～10分钟，自来水冲洗，于低倍显微镜下(×10)观察到移行的细胞核呈紫红色，随机观察5个视野，计数移行细胞数，取均值，实验重复3次。

1.2.4RT-PCR检测 TRIzol一步法提取细胞总RNA，各取1 μg RNA 按 TaKaRa RNA PCR Kit说明书行cDNA合成及PCR扩增，同时以β-actin为内参照。基因Annexin A2引物序列如下(975 bp)：5＇-AAATGTCTACTGTTCACGAAATCC-3＇(正义链);5＇-GTGTCGGGCTTCAGTCATC-3＇(反义链)。对照基因β-actin 引物序列如下(250 bp)：5＇-ACTCTTCCAGCCTTCCTTCC-3＇(正义链);5＇-CATACTCCTGCTTGCTGATCC-3＇(反义链)。

1.2.5细胞转染 pSilencer-Annexin A2载体购于美国Ambion生物工程公司。Annexin A2转录起始点下游94～113 bp的21个碱基为目标片段。应用阳离子脂质体Lipofectamine2000将Annexin A2沉默载体分别转染到高转移细胞系A549和95D中，G418筛选2周后出现稳定表达转染质粒的单细胞克隆株，分别命名为 A549-siAnnexin A2和 95D-siAnnexin A2。

1.2.6Western blot 将全细胞提取物进行SDSPAGE、转膜、抗体结合及显色。分离胶浓度为12%;一抗分别为抗 Annexin A2，mTOR和 β-actin抗体。经辣根过氧化物酶标记的二抗孵育后，按ECL试剂盒说明书曝光处理。

1.3统计学方法 应用SPSS17.0统计软件，采用单因素方差分析及Post Hoc组间比较，对实验结果进行统计学分析，P＜0.05时，差异具有统计学意义。

2 结果

图1 四种肺腺癌细胞中金属蛋白酶的表达Fig．1 Expression of MMP in lung adenocarcinoma cells

2.1四种肺腺癌细胞中金属蛋白酶的表达和细胞移行能力 四种肺腺癌细胞系的金属蛋白酶的表达(图1)，可见肺腺癌细胞系A549和95D中MMP-9的活性明显高于95C和SPC-1-A细胞系(P＜0.01)。Transwell细胞迁移实验表明(图2)，肺腺癌细胞系A549和95D的迁移数目高于95C和SPC-1-A细胞系(P＜0.05)。

图2 四种肺腺癌细胞迁移数目Fig．2 Cell migration numbers in lung adenocarcinoma cells

图3 四种肺腺癌细胞中Annexin A2 mRNA的表达Fig．3 Expression of Annexin A2 mRNA in lung adenocarcinoma cells

2.2四种肺腺癌细胞中Annexin A2 mRNA及蛋白的表达 应用RT-PCR和Western blot分析检测显示，高转移细胞系A549和95D中Annexin A2 mRNA(图3)及蛋白(图4)表达均明显高于低转移细胞系95C和SPC-1-A(P＜0.01)。

2.3沉默载体psilencer-Annexin A2转染后A549和95D细胞的移行能力 Western blot分析显示(图5)，沉默载体psilencer-Annexin A2转染后的A549-si和95D-si细胞中Annexin A2的表达较空载体(psilencer-blank)转染的对照组A549-blk、95D-blk显著下降(P＜0.01)。进一步观察这两个细胞模型的细胞迁移能力，Transwell迁移模型的结果发现(图6)：与正常空质粒转染对照组比较，Annexin A2沉默后，两细胞系的迁移数目降低(P＜0.05)。

图4 四种肺腺癌细胞中Annexin A2蛋白的表达Fig．4 Expression of Annexin A2 protein in lung adenocarcinoma cells

2.4肺腺癌细胞中mTOR蛋白的表达 应用Western blot分析表明(图7)，与低转移潜能细胞系相比较，在高转移潜能的肺癌细胞中p-mTOR呈明显高表达(P＜0.01)，而T-mTOR表达无明显差异。Annexin A2基因表达被沉默后，细胞中p-mTOR表达也明显下降(P＜0.01)。

图6 沉默载体psilencer-Annexin A2转染后，A549和95D细胞的迁移数目Fig．6 Cell migration numbers in A549 and 95D cells after psilencer-Annexin A2 transfection

图7 肺腺癌细胞中mTOR蛋白的表达Fig．7 Expression of mTOR in lung adenocarcinoma cells

3 讨论

具有局部浸润和远距离转移能力是恶性肿瘤最重要的特点，也是恶性肿瘤致命的主要原因之一。因此，Annexin A2与恶性肿瘤这方面特性的关系的研究受到格外重视。Annexin A2与某些S100家族成员、组织型纤溶酶原激活物(tissue-type plasminogen activator，t-PA)、纤溶酶原(Plasminogen，PLG)及腱糖蛋白 C(Tenascin.C，TN-C)等相互作用［4］，使他们在肿瘤细胞表面共区域化，介导tPA依赖的纤溶酶的产生，激活蛋白酶前体，活化基质金属蛋白酶、细胞外基质的重塑及蛋白质水解、新血管形成，促进肿瘤细胞浸润转移［5-7］。

我们分析了四种肺腺癌细胞系中基质金属蛋白酶MMP-9的表达，MMP-9是细胞基质金属蛋白酶家族中最重要的成员，可以直接参与对基底细胞膜的水解，影响细胞的粘附和转移能力。结果表明肺腺癌细胞系A549和95D中MMP-9的活性明显高于95C和SPC-1-A细胞系。同时，Transwell细胞迁移实验也证实，腺癌细胞系A549和95D的迁移数目高于95C和SPC-1-A细胞系。上述结果证实，A549和95D细胞系具有较强的转移潜能。另外，Annexin A2基因在高转移细胞系A549和95D中均呈现高表达状态。这些高表达的Annexin A2在细胞表面作为PLG和t-PA的共同受体，加速了PLG的生成，PLG通过促进金属蛋白酶(MMPs)和潜在生长因子(Latent growth factor，LGF)的活化、膜蛋白的水解、细胞外基质的降解等加速血管生成，促进肿瘤的浸润和转移。进一步应用RNA干扰的方法抑制了Annexin A2基因的表达，使A549和95D细胞的迁移能力显著下降。以上结果说明Annexin A2具有促肺癌细胞增殖和侵袭的作用，从而促进肺癌的发生和发展。

哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)是一个289 kD的高度保守的丝氨酸/苏氨酸激酶，属于 PI3K相关激酶家族(Ptdlns3K-related kinase family)。mTOR对细胞的代谢、生长、增殖、生存和细胞骨架运动等生物过程的调节起着重要的调控作用。研究发现mTOR信号通路参与了肿瘤的形成、血管新生、胰岛素抵抗、脂肪形成、T淋巴细胞激活等过程［8］。由于与肿瘤密切相关，mTOR成为肿瘤治疗的一个重要靶点。雷帕霉素是mTOR的特异性抑制剂，可以抑制肿瘤细胞的增殖，与其他的化疗药物联合应用有望获得更好的治疗效果，但只有mTOR通路在肿瘤中起到重要作用时，该类药物才会表现较好的疗效［9］。磷酸化的mTOR(p-mTOR)是mTOR在信号通路中的激活状态。因此本实验选取p-mTOR作为研究指标，结果显示，在高转移细胞系中p-mTOR呈明显高表达;在沉默了 Annexin A2表达后，细胞中 p-mTOR的活性明显受到抑制。二者表达的密切相关提示了Annexin A2可能是通过激活了细胞内的mTOR信号通路，参与了肺癌细胞转移的发生，但具体的分子机制仍有待进一步研究阐明。

综上所述，本研究结果提示Annexin A2在肺癌转移过程中起关键作用，为阐明肿瘤侵袭转移分子机制、分子靶向治疗及预后评估方面，提供了新思路。抑制其表达或阻断其介导的信号转导通路将有可能为抗肿瘤治疗提供一些较为理想的思路。随着基因剔除和剔减技术的兴起，人们正在进一步揭示Annexin A2与肿瘤发展进程的相关性，但其在肿瘤的发生、浸润、转移过程中的具体作用机制尚有待于进一步探索和拓展。相信随着该基因与恶性肿瘤发展关系的深入研究，它有望被开发为用于肺癌及其转移的早期检测、辅助诊断及治疗的靶分子。

1 Chasserot-Golaz S，Vitale N，Umbrecht-Jenck E et al．Annexin 2 promotes the formation of lipid microdomains required for calciumregulated exocytosis of dense-core vesicles［J］.Mol Biol Cell，2005;16(3)：1108-1119.

2 Huang Y，Jin Y，Yan C H et al．Involvement of Annexin A2 in p53 induced apoptosis in lung cancer［J］.Mol Cell Biochem，2008;309(1-2)：117-123.

3 Zhao P，Zhang W，Tang J et al．Annexin II promotes invasion and migration of human hepatocellular carcinoma cells in vitro via its interaction with HAb18G/CD147［J］.Cancer Sci，2010;101(2)：387-395.

4 Hou Y，Yang L，Mou M et al．Annexin A2 regulates the levels of plasmin，S100A10 and Fascin in L5178Y cells［J］.Cancer Invest，2008;26(8)：809-815.

5 章蔼然，潘 宁，侯颖春et al.膜联蛋白A2与恶性肿瘤发展进程的关系［J］.细胞生物学杂志，2008;30(3)：307-311.

6 Semov A，Moreno M J，Onichtchenko A et al．Metastasis-associated protein S100A4 induces angiogenesis through interaction with Annexin II and accelerated plasmin formation［J］.J Biol Chem，2005;280(21)：20833-20841.

7 Mackie E J.Molecules in focus：tenascin-C［J］.Int J Biochem Cell Biol，1997;29(10)：1133-1137.

8 Laplante M，Sabatini D M.mTOR signaling at a glance［J］.J Cell Sci，2009;122(20)：3589-3594.

9 Chan S，Scheulen M E，Johnston S et al．Phase II study of temsirolimus(CCI-779)，a novel inhibitor of mTOR，in heavily pretreated patients with locally advanced or metastatic breast cancer［J］.J Clin Oncol，2005;23(23)：5314-5322.