直接电位法研究铅离子与牛血清白蛋白的相互作用

江书庆，信建豪，窦运修

（黄河科技学院 医学院，河南 郑州 450063）

铅是一种严重危害人类健康的重金属元素，是出现在人类文明社会中最严重的环境污染物之一，它可以影响人类的各类器官，如神经、造血、消化、泌尿、生殖、心血管、内分泌、免疫、骨骼等［1］。铅中毒问题既是一个古老的问题，又是一个探索不尽的新问题。进入体内的物质要通过血浆贮存与运输才能达到受体部位产生作用，而血清白蛋白可与许多内源和外源性物质结合以形成血清白蛋白的传输功能［2］。

牛血清白蛋白（BSA）是一种球蛋白，具有紧凑的椭圆结构，其原始结构的稳定性主要来自疏水作用。它对大多数小型离子和分子具有很高的亲合力，为了表征小离子或分子与蛋白质的结合作用，通常研究小离子或分子与牛血清白蛋白的结合。研究小离子或小分子与牛血清白蛋白的结合的常用实验方法有直接分光光度法［3］、凝胶过滤方法［4］、荧光光度法［5］和平衡透析法［6］等。直接分光光度法和荧光光度法测定时误差较大，而凝胶过滤法和平衡透析法测定的准确度虽然较高，但是操作起来耗时太长。直接电位法不受溶液的颜色、浊度等影响［7］，具有高选择性、高准确度、快速、方便等优点，用以研究小离子与BSA结合，具广阔的应用前景，但现阶段国内外研究较少［8］。

1946年Klotz等人在研究有机阳离子如甲基橙、氮磺胺噻唑与BSA相互作用时，推导出Klotz方程［6］，方程形式如下：

其中，r为被BSA结合的离子的摩尔数与BSA的总摩尔数的比值，［L］为自由离子的平衡浓度，K为内在分解常数，n为最大结合数。该方程用于直接电位法测定铅离子与BSA的最大结合数和结合平衡常数，获得较好的结果。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

pHS－3CT型精密酸度计（上海大普仪器有限公司）；PXSJ－216型离子活度计（上海雷磁仪器有限公司）；铅离子选择性电极（上海电光器件厂）；217型双接界甘汞电极（内充0.1mol／L的KNO3溶液）；恒速磁力搅拌器（深圳天南海北有限公司）。牛血清白蛋白（BSA）（上海博世化学品有限公司，相对分子量：66，000）；pH5.0的醋酸缓冲溶液；Pb2＋标准溶液：用Pb（NO3）2固体先配制成0.1mol／L的溶液，将该溶液逐级稀释，并在稀释过程中加入缓冲溶液和NaCl作为离子强度调节剂，使pH和离子强度恒定。得到一系列Pb2＋标准溶液备用。其它试剂为分析纯，实验用水为二次蒸馏水。

1.2 实验方法

1.2.1 电极电位的测量方法

铅离子选择性电极使用之前先在1.0×10－3mol／L的Pb（NO3）2溶液中浸泡活化48h，用水冲洗后与217型甘汞电极组成测量电池，连接离子活度计，测量水的空白电位值，待其稳定后即可测量试液。

1.2.2 Pb2＋与BSA相互作用分析

准确称取0.0660gBSA于7个10mL容量瓶中，分别加入1.0mL、0.8mL、0.6mL、0.4mL、0.3mL、0.2mL、0.1mL的10－2mol／L Pb（NO3）2标准溶液，并分别加入计算量的缓冲溶液和NaCl作为离子强度调节剂，使其pH值和离子强度与标准溶液相同，并定容后摇匀。将该系统转移到25mL的烧杯中，在搅拌器上恒速搅拌10min后，用铅离子选择性电极和参比电极组成的测量电池测量其电位。

2 结果

2.1 电极Nernst响应曲线

利用方法“1.2.1”依次测量该电极在1.0×10－7～1.0×10－2（mol／L）的Pb（NO3）2溶液中的电位值E，以电位E对Pb（NO3）2浓度（moL／L）的负对数pC作图，见图1。实验表明在Pb（NO3）2浓度为1.0×10－2～2.0×10－6moL／L范围内，E～pC具有良好的线性关系。在该浓度范围内用线性回归计算出该曲线的线性方程为：E＝－61.13＋28.58pC，Nernst响应斜率为28.58mV／pC，相关系数为0.9993。

2.2 结合位数与平衡常数的计算

图1 铅离子选择性电极的Nernst响应曲线

2.3 实验条件的优化

为了使测定结果更加准确和稳定，测试液的pH和离子强度经过精确调节，并用磁力搅拌器恒速搅拌，此时铅离子选择性电极所检测信号的重现性良好，平均相对偏差不大于1.3%（n＝4）。

图2 铅离子与BSA相互作用

铅离子与BSA的结合速度较快，使用铅离子选择性电极监测铅离子与BSA结合过程，实验表明10min后电位达到了恒定，证明10min后铅离子与BSA结合达到了平衡。所以实验选择10min作为相互作用时间。

2.4 干扰实验

利用铅离子选择性电极测定溶液中其他组分的选择性系数用以证明这些组分是否会对测定产生干扰，实验表明，溶液中存在的各组分的选择性系数均小于10－4。证明该体系无明显干扰。

3 结论

本实验与文献［9］进行比较，其结果出入较大。原因可能在于荧光分析中，虽然以静态猝灭为主，但动态猝灭可能同时存在，造成结果误差。直接电位法检测的是自由铅离子的浓度，其他组分干扰较小，结果可能更加准确。

［1］王蟹，徐辉碧，屠任覆，等.生命科学中的微量元素（下卷）［M］.北京：中国计量出版社，1992：566－5881.

［2］ULRICH KH.Molecular aspects of ligand binding to serum albumin［J］.Pharmacol Rev，1981，33（1）：17－53.

［3］OHYOSHI E，HAMADA Y，NAKATA K，KOHATA S.The interaction between human and bovine serum albumin and zinc studied by a competitive spectrophotometry［J］.Journal of Inorganic Biochemistry，1999，75（12）：213－218.

［4］YOUNG D A B，CIMASONI G.Gibbs－donnon and adsorption effects in the study of the binding of fluoride to albumin by gel filtration［J］.Biochemicaet Biophysica Acta，1974，342（15）：333－342.

［5］YAN WANG，YAN CHENG，HONG FANG SUN.Interaction of nicotine and bovine serum albumin［J］.Chinese Chemical Letters，2000，11（3）：247－250

［6］KLOTZ I M，WALKER，F M，PIVAN R B.The binding of organic ions by proteins［J］.Journal of American Chemical Society，1996，68（15）：486－1490.

［7］汪世花，马军霞.离子选择电极示踪技术及其应用与展望［J］.勘察科学技术，2001，12（5）.

［8］EROL AYRANCI，OSMAN DUMAN.Binding of fluoride，Bromide and iodide to bovine serum albumin studied with ionselective electrodes［J］.Food Chemistry，2004，84（5）：539－543.

［9］吴根华，汪春华.荧光法研究Pb2＋与牛血清白蛋白的相互作用［J］.光谱学与光谱分析，2005，18（2）.