改良抗酸染色法的经验交流

庞霞 尹玉慧 宋一民 赵华莹 陈月 高冬玲

抗酸杆菌（acid fast bacili）体内含有脂质、蛋白质和多糖类，由糖脂形成一个蜡质的外壳，它有特殊功用，如对一般染料不宜着色，但能与苯酚碱性复红结合成复合物，这种复合物能抵抗酸溶液的脱色作用，所以成为抗酸杆菌[1]。实验室常用Ziehl-Neelsen方法，但存在一些弊端，故作者尝试对该方法进行改良，效果显著，现介绍如下。

1 材料与方法

1.1 材料

来自郑州大学第一附属医院每天送验的新鲜手术标本。

1.2 溶液配制

①10%高碘酸水溶液：高碘酸10g，蒸馏水加至100ml。配制后置4～8℃冰箱保存，可用半年；②碱性复红酒精溶液：碱性复红 1g，用无水酒精 10ml配制。③5%苯酚水溶液：苯酚 5ml、蒸馏水加至100ml。④苯酚碱性复红溶液：碱性复红酒精溶液10ml和5%苯酚水溶液90ml混合，用前过滤。⑤20%硫酸水溶液

1.3 方法

①组织常规脱水包埋，切片厚度4～6μm待用。②将切片用等量的汽油和松节油混合液脱蜡三次，每次10min。③不用梯度酒精处理，只用吸水纸吸干油液。④水洗 5min。⑤10%高碘酸水溶液室温氧化20 min后充分水洗。⑥滴加苯酚碱性复红溶液在75℃的烤片机上染20min后水洗。⑦用20%硫酸水溶液分化至适当为止，充分水洗。⑧吸干水分，入烤箱烘干、封固。

2 结果

抗酸杆菌经染色后呈鲜红色，背景干净，有利于提高诊断率，并且可以长期保存。

3 讨论

目前结核病的发病率呈逐渐上升趋势水平，抗酸染色是检测结核病重要病理诊断之一，由于染色试剂和染色技术是影响抗酸染色质量的重要因素，根据多年的经验浅谈如下：①适当增加切片的厚度，4～6μm 最为适宜，可以提高检出率。②用二甲苯脱蜡可溶解抗酸菌脂质外壳，致抗酸性随之减弱或消失，不易染色，可见脱蜡是关键性工作[2]。等量的汽油和松节油混合液脱蜡即保存菌体脂质，使菌体壁等不受破坏，也保存菌体壁的完整性。另外脱蜡后禁止洒精洗，以防酒精对菌体内脂质的破坏，降低染色效果。应注意的是：脱蜡剂配制汽油和松节油要相等，脱蜡剂使用时间不能过长，要随时更换。③研究发现：经高碘酸氧化后，染出的片子不但颜色鲜艳，而且可以长期保存。高碘酸能使抗酸杆菌菌壁上的糖脂两个相邻的带有羟基键打开而氧化成醛基，而碱性品红能与醛基发生反应[3]，产生抗酸性的紫红色基团，从而使苯酚碱性复红与抗酸杆菌结合更加牢固。④我们根据抗酸杆菌的细胞结构和特点对染色试剂加以改良配制。用苯酚碱性品红液，它易与抗酸菌酸牢固结合生成复红一抗酸菌酸复合物，一旦染上颜色[4]，由于脂质的存在，即使强脱色剂也不容易使之脱色。并且我们用无水酒精来最大限度地溶解碱性品红，而以苯酚作为媒染剂，以提高染料染色性能，使碱性品红与抗酸杆菌牢固结合，提高了染色效果。但苯酚碱性品红液极易出现沉淀，滴染时要过滤后再染。⑤结核杆菌的菌体含有脂质外壳，具有抗一般染料难以渗入菌体，故结核杆菌着色困难，所以染色过程中需加热。传统的加热方法是用酒精灯火焰加热，但酒精灯火焰温度过高，加热不均不易控制，并且容易脱片。作者实践中发现在 75℃的烤片机上染色，可以避免以上的弊端，但注意的是：加热过程中，在烤片机上放一张吸水纸，防止平移载玻片染液外溢，污染烤片机；并且随时补加染液，防止干燥产生假阳性。⑥研究还发现，不复染可避免美兰染色背景掩盖菌体颜色出现假阴性，使抗酸杆菌的红色颗粒更易于识别。⑦20%硫酸水溶液褪色较弱，时间稍长影响不大。

[1]许文兵.表面活性剂在 Wade-Fite法中的应用[J].临床与实验病理学杂志,2005,21(6):645

[2]梁建中,武延隽,车德才.改良传统组织切片抗酸染色法[J].广东医学,2005,6(11):1545.

[3]张万鹏,韩建德,金东勋,等.高碘酸在抗酸染色中的应用[J].中国麻风皮肤病杂志,2006,22(7):537.

[4]沈武成,蔡晓雯.改良抗酸染色法的体会[J].医药论坛杂志,2008,29(24):97-98.