应用鸡胚活体电转GFP示踪技术观察脊髓左右两侧神经元纤维投射①

杨慈清 石晓卫 胡阿珍 贾阳阳 郭志坤 林俊堂 (新乡医学院生命科学技术系，新乡453003)

应用鸡胚活体电转GFP示踪技术观察脊髓左右两侧神经元纤维投射①

杨慈清 石晓卫 胡阿珍②贾阳阳②郭志坤②林俊堂 (新乡医学院生命科学技术系，新乡453003)

目的:探索鸡胚发育过程中，脊髓左右侧神经元经纤维之间的联系，为脊髓两侧神经纤维投射提供形态学基础;方法:采用鸡胚带壳开窗培养技术，待胚胎发育至第3天，通过活体电转基因，将pCAGGS-GFP质粒0.1～0.5 μl准确注射到脊柱，在电压18 V、每次脉冲60 ms，间隔100 ms，电脉冲6次的条件下进行定时定位活体电转基因，电转后6小时开始到10天，分别收集胚胎，甲醛固定冰冻切片，DAPI染细胞核观察组织形态结构变化。结果:电转后6小时便可以观察到GFP的表达，24小时后可以看到GFP标记细胞纤维的投射，3天可以清晰的观察到转入GFP一侧脊髓的运动神经元纤维束投射到另外一侧脊髓。结论:电转GFP成功标记运动神经元纤维在脊髓左右两侧的投射。

鸡胚;胚胎发育;活体电转;纤维投射

脊椎动物胚胎发育是一个非常复杂的过程，而神经系统的发育较其他系统要早，神经系统来源于神经外胚层，由神经管和神经嵴分化而来，在早期胚胎发育过程中，神经嵴是周围神经系统的原基，神经管是中枢神经的原基，神经管的头段分化为脑，尾段分化为脊髓。如果神经管没有完全闭合就会引起多种类型先天畸形，如脊柱裂、脑裂等。在神经管不同的部位存在不同的神经细胞，如神经管侧板背侧的成神经细胞分化为感觉神经元，而运动神经元由侧板腹侧成神经细胞分化而来[1]。在中枢神经系统中，神经元纤维存在交互作用[2，3]，Lodin[4]在鸡胚背根神经节组织培养过程中观察到轴-轴或轴-体突触。脑中不同神经元具有不同的功能，目前，对其神经纤维的投射研究较多[5，6]，但对于脊髓中神经纤维的投射研究较少，尤其是胚胎发育过程，杨琳等[7]曾以成年大鼠作为动物模型，应用辣根过氧化物酶逆行标记左右侧脊神经节间纤维的联系。本研究以鸡胚为动物模型，采用活体原位电转GFP技术，利用GFP蛋白自发荧光的特点，研究胚胎发育过程脊髓左右两侧神经元纤维的投射，为脊髓两侧神经纤维的联系提供形态学证据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器 pCAGGS-GFP(绿色荧光蛋白)质粒由Redies博士馈赠，本实验室扩繁提取;一抗mouse anti Neurofilament单克隆抗体(武汉博士德);二抗Goat anti mouse Cy3标记(中杉金桥);Mounting Medium with DAPI(中杉金桥);质粒DNA大量提取试剂盒(北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司);种鸡蛋(本地种鸡场);CUY-21(BEX)型多功能活体电转仪(日本NEPA公司);M205FA型倒置体视荧光显微镜(德国Leica公司);Nikon ECLIPSE 80i荧光显微镜(日本Nikon);CM1850冰冻切片机(德国Leica)。

1.2 方法

1.2.1 原位电转基因方法 转染具体过程，鸡胚带壳开窗培养，待胚胎发育到第3天，取出鸡胚，侧面开口2～3 cm直径大小，在体视显微镜下，使用毛细管注射针，将 2 μg/μl的 pCAGGS-GFP 质粒 0.1 ～0.5 μl准确注射到脊髓腔，用针状电极置脊椎两侧，确保电极与组织之间有一定空隙，使用电转仪进行电转，电转电压18V，每次电击60 ms，间隔100 ms，电脉冲6次，整个过程在无菌操作工作台内完成，转染后分别在6、12、24、48、72 小时和第10 天各取出 3 个转染胚胎，在倒置体视荧光显微镜下观察结果，电转部位呈现绿色荧光者(绿色荧光蛋白GFP颜色)视为阳性。1.2.2 取材及切片 倒置体视荧光显微镜下观察阳性表达的胚胎，在体视显微镜下，采用尖头镊子划破卵黄膜，取出整个胚胎，转移至4℃预冷处理的PBS液漂洗2～3次，置于4%PFA(多聚甲醛)中，置保温盒冰块中摇床摇晃过夜，取出组织，吸干液体，转移到18%蔗糖溶液置冰盒中摇晃过夜，等组织沉淀到管底时取出组织吸干液体，根据组织大小，用锡箔纸做好模型，用OCT包埋，注意方向，头朝上，确定好位置，置于液氮中冷冻后放－80℃冰箱保存，切片时取出已包埋的组织，在冰冻切片机上连续切片，一次5～10张载玻片，每张片子根据组织大小循环贴2～3行，5～10列，切片后置烤片机37℃烤片30分钟以上，置 －80℃冰箱保存备用。

1.2.3 荧光免疫组织化学染色 从－80℃低温冰箱中取出的冰冻切片40℃干燥20分钟，4%PFA中4℃固定15分钟，用1×TBS清洗三次，每次5分钟，在含0.1%Triton X-100的1×TBS中再孵育5分钟。每张载玻片上加1 ml免疫组化封闭液，湿盒中孵育1小时。去除封闭液后每张载玻片加300 μl经用封闭液稀释的合适浓度Mouse anti Neurofilament(1∶300)一抗，对照组一抗稀释液中不加抗体，4℃孵育过夜后，1×TBS清洗三次，每次5分钟，然后每张片加300 μl用封闭液稀释的用Cy3标记的Goat anti mouse二抗，室温孵育1小时后，用1×TBS清洗三次，每次5分钟。最后滴加DAPI封片剂染色10分钟，加盖玻片，在荧光显微镜下观察拍照。

1.2.4 图像处理分析 用Photoshop CS3软件处理图片，可将两种染色同位叠加在一起，从而分析不同蛋白质的表达定位。

2 结果

2.1 脊髓左右两侧神经元纤维投射 脊髓活体电转能够实现基因的定时和定位转染，在转染过程中能够准确的转染到一侧脊髓(如图1所示)，而另外一侧可以直接作为对照组，在转染过程中，很好的控制GFP只转染到一侧的脊髓神经元内，在本实验中，利用其单侧转染特点，进行神经元迁移和纤维投射的研究。在实现定位转染的基础上，根据转染时间的不同可以观察被标记神经元的迁移及神经纤维的投射状况，转染后6小时便可以观察到GFP的表达(图1A)，24小时可以观察到被标记神经元纤维投射现象(图1B)，随着时间的延长，投射现象的标记更加清晰，相对随着时间的延长，荧光表达强度有所降低，而将胚胎培养到第10天即3天转染GFP后7天时，组织切片在另外一侧也可以看到少量神经元细胞内表达GFP(图1F、G星号)。图(1D、G)中可以看到，在脊神经节中有表达绿色荧光蛋白的细胞，提示，脊神经节细胞具有向对侧迁移的机制。

2.2 NF及GFP双标 在胚胎发育第3天活体电转5天后GFP仍呈强表达(图2A～C)，组织切片可以清晰的观察到表达的胞体和纤维结构(图2E、I)，从图中(图2E、I)可以看到，脊髓腹侧中间运动神经元(Medial motor neuron column)纤维跨越底板(Floor plate)下方的腹侧白质(Ventral white column)区到达对侧脊髓的侧白质区。作为神经骨架蛋白的指标NF(Neurofilament)主要表达在神经纤维，对其标记可以反映出神经元生长的状态。从图中(图2F、J)可以看出，与对照组(图2F)相比，实验组(图2J)中箭头所示为NF阳性表达结果，从叠加图(图2K)可以清晰的看出，NF表达部位与GFP表达的部位吻合，属于同一神经纤维内表达的蛋白。

图1 鸡胚胎发育过程脊髓两侧纤维投射Fig.1 The projection of neuron fiber in spinal cord both side during the development of chick embryo

图2 转入GFP鸡胚NF表达Fig.2 The expression of neurofilament in chicken embryos after in vivo electroporation with pCAGGS-GFP

3 讨论

细胞示踪技术是跟踪细胞迁移和神经纤维投射最常用的方法，目前，示踪技术多用生物素葡聚糖胺或辣根过氧化物酶进行局部注射跟踪，最后通过显色剂显色，便可以观察到细胞从特定位置迁移途径或纤维投射的方向。而绿色荧光蛋白GFP是近年来广泛使用的报告基因表达蛋白，其特点是不需要特殊的染色或显色剂显色，在荧光显微镜下便可以发出绿色荧光，与其他生物素化或酶标记的底物相比，观察更为方便，定位准确，无毒副作用等，随着活体电转基因技术的发展，GFP被作为活体内电转基因过程中的报告基因被广泛使用，可以将目的基因与GFP构建成融合基因，通过载体上共用启动子共同转录表达，或在同一种表达载体上，通过不同启动子转录表达，也可以将目的基因与GFP共转染，通过GFP可以确定目的基因表达状况，进一步检测。通过前期的实验已经证明，GFP的表达并不影响鸡胚胎发育及相关蛋白的表达，可以作为活体基因转染中的报告基因，在本实验中利用活体原位电转基因技术，在实现定时定位和定向转染的基础上，对脊髓左右侧神经元纤维投射的联系进行示踪，从结果中可以看到，由于电转过程，质粒带负电荷会向电场的正极进行移动，在电脉冲情况下，细胞膜通透性会变化，瞬时进入细胞内，利用表达载体自身的系统进行蛋白质的合成，示踪效果明显，能够很直观的观察到神经元和神经纤维的投射。

在实验过程中，也对转染后不同时间的胚胎取材，观察示踪结果，从结果中看出，pCAGGS-GFP质粒转染后6小时便会观察到GFP的表达，24小时时会看到神经纤维中GFP的表达，根据荧光可以看出纤维投射的方向，这种结果在48小时后更为清楚，但随着时间的延长GFP的表达会减弱，在胚胎发育的第10天即转入GFP质粒7天后观察时，发现荧光强度不是很强，但纤维的联系非常清楚，除纤维联系外，可以观察到少量细胞向对侧迁移，即说明在脊髓两侧进行着必要的联系。刘娜等[8]在成年大鼠上采用生物素化葡聚糖胺逆行标记技术研究结果证明，一侧背根节神经元纤维可到达两侧背角及背外侧束，左右侧脊神经节间的联系纤维走行的位置可能主要位于中央管后方，且与后连合核有关，在本研究中主要选择早期鸡胚胎发育过程，根据GFP表达可以看出，脊神经节细胞可以从一侧迁移至对侧，中间运动神经元纤维经腹侧白质到达对侧，而侧运动神经元纤维向下角外投射，提示中间运动神经元与对侧存在必要联系，侧运动神经元纤维通过神经节间隙联系到脊髓外组织。

实验中对神经丝蛋白进行标记，神经丝蛋白是神经细胞的骨架蛋白，为大直径有髓轴突含量最高的成分，是反映神经元功能状况的内在标志物[9]。免疫组织化学染色检测NF可以较灵敏地反映神经轴突的形态变化。NF是构成神经元胞体和神经轴突细胞骨架的主要成分，在维护神经元的功能和轴浆转运等一系列与脊髓损伤修复相关的病理生理变化中发挥着重要作用。故NF作为神经骨架蛋白的指标，可提示神经元生长的状态[10]。在结果中看到，NF表达与GFP在纤维中的表达部位重叠，提示GFP也是在细胞骨架中，根据其能够明显的标记出细胞骨架结构，同时也能够清晰观察到纤维结构，本研究只局限于胚胎发育过程中的纤维投射，对于成体纤维投射还待于进一步研究。

1 孔卫国，吴晓牧，张昆南et al.诱导人骨髓间充质干细胞向运动神经元分化的研究[J].江西医学院学报，2009;49(9):1-4.

2 Xu G Y，Zhao Z Q.Cross-inhibition of mechanoreceptive inputs in dorsal root ganglia of peripheral inflammatory cats[J].Brain Res，2003;970(1-2):188-194.

3 Devor M，Wall P D.Cross-excitation in dorsal root ganglia of nerve-injured and intact rats[J].J Neurophysiol，1990;64(6):1733-1746.

4 Lodin Z，Faltin J，Booher J et al.Fiber formation and myelinization of cultivated dissociated neurons from chicken dorsal root ganglia:an electron microscopic and scanning electron microscopic study[J].Neurobiology，1973;3(2):66-87.

5 潘 剑，黄绍明，陈婷婷et al.大鼠小脑旁绒球的传入纤维投射[J].广西医科大学学报，2010;27(3):368-369.

6 Lois J H，Rice C D，Yates B J.Neural circuits controlling diaphragm function in the cat revealed by transneuronal tracing[J].J Appl Physiol，2009;106(1):138-152.

7 杨 琳，刘 娜，杨连雪et al.应用辣根过氧化物酶逆行示踪技术观察左右侧脊神经节间纤维联系[J].中国临床康复，2005;9 (41):32-33.

8 刘 娜，杨连雪，杨 琳et al.应用生物素化葡聚糖胺顺行示踪技术探索左右侧脊神经节间纤维的联系[J].中国临床康复，2005; 9(41):22-24.

9 李晓捷，宋 锐，孙忠人.针刺对脑损伤仔鼠脑神经丝蛋白表达的影响[J].中国康复理论与实践，2009;15(3):206-207.

10 Uchida K，Baba H，Maczawa Y et al.Progressive changes in neurofilament proteins and growth associated protein-43 immunoreactivities at the site of cervical spinal cord compression in spinal hyerostotic mice[J].Spine，2002;27(5):480-487.

[收稿2011-11-20 修回2012-03-16]

(编辑 倪 鹏)

Observation of projections between the left and right spinal cord neuron fibers with electroporation GFP tracing technique in vivo of chick embryo

YANG Ci-Qing，SHI Xiao-Wei，HU A-Zhen，JIA Yang-Yang，GUO Zhi-Kun，LIN Jun-Tang.Department of Life Science and Technology，Xinxiang Medical University，Xinxiang 453003，China

Objective:To explore the connection between the left and right side spinal cord neurons fiber during the development of the chick embryo，in order to provide the morphological basic information for the projection of the nerve fibers on both sides of the spinal cord.MethodspCAGGS-GFP was transformed into spinal cord of chicken embryos which was used to in ovo culture technique until the embryos developed to 3 d.The condition of in vivo electroporation was voltage 18 V，each pulse 60 ms，interval 100 ms and 6 times pulse.The embryo after electroporation from 6 hours to 10 days were collected and fixed with 4%PFA and frozen sections，nucleus was stained with DAPI.ResultsThe GFP expression was be observed at the time of 6 hours after in vivo electroporation，the projection of fiber which was labeled GFP was observed after 24 hours and three days later the spinal cord motor neuron fibers projected onto the other side of the spinal cord was clearly obserred.ConclusionIn vivo electroporation GFP successfully marked motor neuron fibers projection between the two sides of the spinal cord during the development of chick embryo.

Chick embryo;Embryo development;In vivo electroporation;Fiber projection

Q954.48

A

1000-484X(2012)08-0718-04

10.3969/j.issn.1000-484X.2012.08.010①本文为2010年国家自然科学基金(No.31000475)和2011年新乡

医学院重点研究领域招标课题资助项目(No.ZD2011-26)②新乡医学院河南省医用组织再生重点实验室，新乡453003

杨慈清(1979年－)，男，在读博士，讲师，主要从事发育神经生物学研究;

及指导教师:林俊堂(1976年－)，男，博士，主要从事发育生物学方面研究，E-mail:linjuntang2002@yahoo.co.uk。

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