海洋真菌AP2T1菌株介质阻挡放电等离子体诱变初步研究

张 翼，穆 军，董学伟，冯妍，毛锐涛，修志龙

(1.大连理工大学生命科学与技术学院，辽宁大连116024;2.大连交通大学环境与化学工程学院，辽宁大连116028)

0 引言

海洋微生物具有丰富的物种资源以及产生多样化药物活性先导化合物的巨大潜力，是近20年来海洋天然药物研究的最热点领域.在海洋微生物药物研究中，挖掘现有菌种资源的药用潜力与开发新的极端环境微生物资源是不可偏废的两个方面.对于前者来说，主要目标是通过人为地干预来提高微量活性物质的产量或促使菌株产生结构上更丰富多彩的新的活性化合物.事实上，很多微生物都具有丰富的沉默代谢途径，有巨大的潜力可供挖掘.特别是在对于目标化合物的生物合成途径尚不明确的情况下，诱变育种其实是提高菌株性能的一个现实而有效的手段.目前关于陆地药源微生物诱变育种的研究很多，手段丰富多样，也有很好的效果，青霉素产量的巨大提高就是一个典型的例子，但海洋药源微生物相关报道却比较少.

等离子体诱变是近年出现的一种微生物诱变新技术.等离子体是指由部分电子被剥夺后的原子及原子被电离后产生的正负电子组成的离子化气体状物质，呈现出高度激发的不稳定态，其中包含了多种理化诱变复合因素，而且常/低温条件下产生的等离子体对生物材料热致死效应较小，因此可有效的引起基因突变，产生高产优质或具有新性状的新菌种，具有诱变机制独特、诱变效率高、操作简单、成本低、安全无污染等诸多优点［1］.但迄今为止，尚未见到国内外将等离子体用于海洋真菌等海洋药源微生物育种研究的相关报道.

本文运用介质阻挡放电大气压低温等离子体技术对海洋真菌的等离子体诱变育种进行了初步的探索研究，包括诱变方式、诱变条件、活性筛选方法及小规模的诱变处理效果研究.

1 实验方法

1.1 材料、试剂与仪器

海洋真菌菌株：菌株AP2T1，壳青霉(Penicillium crustosum)，本实验室分离自中国东海海域捕获大白鲨鳃部.活性指示菌：DNA损伤修复基因缺陷的大肠埃希氏菌(Eschrichia coli AB3027，下文简写为DDRT(-)菌株)，购自美国耶鲁大学大肠杆菌库.

培养基：海洋真菌培养：海水马铃薯培养基(200 g土豆加入500 mL去离子水，煮沸15 min，纱布过滤得土豆汁，加去离子水定容至500 mL，加入天然粗海盐配制过滤海水500 mL(40g/L)，蔗糖20 g，琼脂20 g，121℃ 高压灭菌15 min待用);大肠杆菌培养：营养琼脂培养基(蛋白胨10 g，氯化钠 5 g，牛肉膏 3 g，琼脂 15 g，加入500 mL水，pH 7.2 ±0.2，121℃ 高压灭菌15 min 待用).各种器材，高压灭菌后使用.

辅助化学诱变剂：无水氯化锂、5-氟尿嘧啶(5-FU)、硫酸二乙酯.所用试剂均为分析纯.

等离子体发生器(大连理工大学自加工仪器)，超净工作台(上海博讯医疗设备厂)，恒温培养箱(上海跃进医疗器械厂)，恒温摇床(江苏太仓式实验设备厂)，CX-31型光学显微镜(日本奥林巴斯公司)，RE-2000A型旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)，三用紫外分析仪(上海精科实业有限公司).

1.2 单孢子悬液制备

将出发菌株AP2T1从菌种斜面接种海水马铃薯培养基(M-PSA)平板，于28℃培养2～3 d;从平板上挑取单菌落接种装有150 mL M-PSA培养基的锥形瓶中，无菌透气膜封口，于在28℃恒温箱培养7～15 d，至产生大量孢子.向瓶中加入9 g/L的无菌生理盐水，洗下孢子，转移至装有无菌玻璃珠的锥形瓶中，摇15～20 min，以分散孢子，使用无菌滤器过滤得单孢子悬液(滤器仿照文献方法［2］，由塞有适量脱脂棉的移液枪头、乳胶管、移液管顺序连接而成，灭菌烘干后备用).孢子分散效果由显微镜检检验.将上述单孢子悬液转移到灭好菌的离心管中，用血球计数器计数并进行梯度稀释，将孢子浓度调至5×103个/mL.

1.3 等离子诱变处理方法

等离子体发生器结构如图1所示［3］，不锈钢腔体上装有上下平板金属电极，上电极被石英筒包覆，使用之前，先对操作间使用紫外灭菌30 min，等离子发生器开启15 min灭菌，然后将需诱变的涂布有制备好的50 μL真菌单孢子悬液的培养基平板置于两电极之间，两电极间通有高压电，其电极间距、电压及放电频率可调，当电极间距、电压、频率达到临界值时，两电极间的空气介质就会被击穿，产生等离子体放电现象，等离子体产生的复合诱变因素就会作用于真菌刚刚萌发的孢子，使其发生基因突变［3-4］.

图1 介质阻挡放电等离子体发生器结构示意图

1.4 等离子放电条件探索

将准备好的涂好有单孢子的平板，放入等离子体中使上电极与琼脂的距离为3 mm，打开开关，调电压示数为25(相当于8 kV)，再调节频率至临界值，使等离子体刚好放电，固定频率旋钮，秒表到达诱变时间后，将电压旋钮调零，关闭电源，诱变时间设置如下：0.5，1，1.5，2，2.5，3，3.5，4，4.5，5，6，7，8，9，10 min，每个时间点设两个平行平板.诱变处理后，将平板于28℃倒置培养至长出菌落后计数，计算相应时间点的致死率，即致死率(%)=(1-存活菌落平均数/未诱变的对照平板菌落平均数)*100.

1.5 等离子体诱变方式比较

为研究菌株在单纯等离子体诱变、等离子体与一种或两种化学诱变剂复合诱变条件下的存活能力，并寻找致死能力适中的化学辅助诱变剂，设计如下表1所示试验.即只使用等离子体对菌株进行诱变试验，或在培养集中预先添加一种或两种化学诱变剂进行辅助诱变，或在等离子体诱变之前对孢子悬液进行化学诱变剂的预处理.为便于在同一天内完成大量的诱变处理，每个时间点设置两个平行，计算致死率.所用化学诱变剂的终浓度参照文献用量，分别为：氯化锂5 g/L［5-6］，5-FU 10 μg/mL［5-6］，硫酸二乙酯(DES)2%［7-8］.其中硫酸二乙酯的处理方法：在单孢子菌悬液中加入DES与50%的乙醇溶液混合，使DES的终浓度为2.0%，作用10 min后，加入1/2体积的25%的硫代硫酸钠溶液终止反应［7-8］.

表1 诱变条件比较试验设计

1.6 等离子体诱变致死曲线

选取致死效应适中的诱变条件，细化诱变时间设置，增加实验重复，以研究等离子体诱变的致死曲线，为今后大规模诱变处理选择最适条件.分别为单纯等离子体诱变，时间点设置为10，20，30，40，50，60，90，120，150 s;等离子体 - 氯化锂复合诱变，时间点设置为 10，20，30，40，50，60 s.

1.7 诱变菌株筛选方法

诱变菌株的活性筛选采用初筛与复筛相结合的方法［9］.以E.coli DDRT(-)菌株为指示菌，将菌种于37℃活化传两代，用无菌生理盐水洗下第二代菌体，并稀释至0.5麦氏比浊度，取新鲜配制的菌液100 μL涂布于营养琼脂平板，备用.

初筛采用平板琼脂块扩散法：将诱变平板上的存活菌落一一编号，用无菌牙签接种小斜面保藏菌种，并同时接种到新的M-PSA平板上.在平板上28℃培养7天后，用无菌打孔器切下菌落，转移到上述涂布有DDRT(-)指示菌的营养琼脂平板上，正置于4℃冰箱中扩散一夜，第二天取出置于37℃恒温箱中培养24 h，观察抑菌效果.

采用摇瓶培养-滤纸片法：将初筛活性菌株接种到盛有100 mL海水马铃薯蔗糖液体培养基(同上M-PSA固体培养基成分，但不含琼脂)的250 mL三角烧瓶中，无菌透气膜封口，28℃下180 r/m转速振荡培养5天，再加入50 mL乙酸乙酯振荡过夜杀菌，抽滤，滤渣加入50 mL甲醇，超声提取1h.滤液分层分离得乙酸乙酯相，再每次加入50 mL乙酸乙酯萃取两遍，将两种提取物旋转蒸发仪减压浓缩，并合并得到总粗提物，蒸干.加入2 mL甲醇溶解样品，转移入置于小瓶中待测活.取20 μL提取物加于5 mm直径厚滤纸片，晾干后贴放到上述涂布有指示菌的平板上，同样方法测定抑菌圈直径，每个样品测三个平行，取平均值.

2 结果与分析

2.1 等离子放电条件探索

试验发现当等离子体发生器的上平板电极与琼脂的距离为3 mm，电压为8 kV，频率调节至5.0 kHz时等离子体发生器达到临界状态，可观察到蓝色的火花状等离子体放电现象.由于过强的等离子体致死效应太强，故本实验中采用了最低的临界电流值，使等离子体强度维持在最低状态，而主要通过放电作用时间来调节诱变剂量.在本实验条件下，发现当放电时间超过5 min时，孢子存活率都接近于零(图2).故下面的试验中主要研究了不同条件下较短放电时间内的效果，并缩短了时间间隔.

图2 初步放电条件摸索

2.2 等离子体诱变方式比较

试验发现化学诱变剂5-FU、DES在当前剂量下致死作用过强，无论单独使用或是与等离子体、等离子体-其他化学诱变剂复合使用，在所有时间点的平板上均未发现存活菌落，而在更低剂量下它们或许也可作为本菌株的辅助诱变剂，这有待深入考察;而氯化锂本身未表现出明显致死效应性，添加0.5%氯化锂的对照平板与普通的MPSA对照平板均生长有数量相近的大量菌落(约200个).等离子体单独诱变与等离子体-氯化锂复合诱变对菌株AP2T1有较适中的致死效应，其在90 s内致死率小于100%(图3)，可能是较适合该菌株的诱变条件.另外，从形态上看，等离子体-氯化锂复合诱变的存活菌落普遍要比对照菌及等离子体单独诱变的存活菌落小(图4)，这表明复合诱变可能对菌株具有不同的诱变机制.为绘制这两种诱变条件较精确的致死曲线，下面的试验中进一步在90 s内设置了间隔更短的时间点，并每个时间点的平行试验增至5个.

图3 不同诱变条件的粗略致死曲线

图4 菌株AP2T1等离子体、等离子体-LiCl诱变平板

2.3 等离子体诱变致死曲线

诱变剂量通常用致死率来衡量，因此致死曲线的研究对于寻找合适的诱变剂量非常重要.精确试验表明，对于菌株AP2T1，等离子体单独诱变和等离子体-氯化锂复合诱变分别在15～55 s、35～55 s作用时间范围内可达到合适的致死率，即被普遍接受的较适宜诱变育种的75%～85%的致死率(图4);而且它们的致死曲线在高致死剂量呈现小的饱和峰现象，即在一定时间(剂量)范围内，随着时间(剂量)的增加，致死率会出现先升-降-升的波动，与前人报道的细菌等离子体诱变规律相似［4］，说明丝状真菌的孢子在等离子体诱变达到一定剂量时也会激活其细胞内的修复机制，以降低致死率，但随着诱变剂量进一步提高修复机制不足以抵抗致死因素时，致死率会进一步升高.而且等离子体单独诱变与等离子体-氯化锂复合诱变的致死曲线饱和峰的数量、位置也有差异，这可能从另一方面也揭示了这两种诱变方式可能存在有差异的机制.

图5 菌株AP2T1等离子体诱变致死曲线

2.4 诱变菌株筛选

本实验中采用了一株具有DNA损伤修复基因缺陷型的特殊大肠杆菌作为指示菌，该指示菌对于基于DNA损伤机制的抗肿瘤、抗菌药物比较敏感，是一种方便高效的筛选指示模型［10-11］.对2.2中等离子体单独诱变、等离子体-氯化锂复合诱变得到的300余个存活菌落进行了拮抗DDRT(-)指示菌的活性筛选，并以同期培养的未诱变菌落作为初筛对照(表2).发现在300余个存活菌落中有一个单纯等离子体诱变得到的菌落D-5-D-23显示了较显著的抑菌圈，其圈与菌落琼脂块本身直径之比可达3;而用作对照的未诱变菌落(同时也是出发菌株)可能因为在三角瓶中产孢培养时间过长，接近15天，导致原菌株的孢子过老或因积累有害代谢产物发生衰变，导致菌株退化，故原菌对照活性较弱，圈/菌块直径比只有1.7.这表明等离子体确实可能激活了出发菌株中已经衰退的活性物质代谢途径，具有复苏作用.将该突变株与新鲜培养的出发菌株同时接种海水马铃薯液体培养基摇床发酵五天后，用有机溶剂提取得到的总粗提物都显示了对于DDRT(-)指示菌的抑制活性，而且突变菌株的活性相对于出发菌株确有增强.

表2 活性突变株活性筛选

可能因为本次初步小规模试验采用的孢子培养过老，导致菌种退化，也因此弱化了诱变菌株的产活性物质基础;另外由于此次工作规模的限制，并没有以最佳诱变剂量进行大规模的诱变处理和菌株筛选工作，这些原因使得诱变效果并非特别理想，但上述结果仍显示等离子体的确可以激活该海洋真菌菌株衰退的代谢潜力，增强其生物活性.

3 结论

诱变育种是培育优良菌种的有效手段，海洋微生物是富有潜力的海洋药物可持续利用资源，而目前对于海洋药源微生物的诱变育种研究工作国内外均处于起步阶段，等离子体技术在育种方面具有诱变效率高、操作简单、安全廉价等优点，目前尚未见到该技术用于海洋药源微生物育种的研究报道.

本文建立了一套用于海洋药源真菌单孢子诱变育种的研究方法，包括等离子诱变条件、方式和合适剂量的探索，发现在15(或35)～55 s时间剂量内的等离子体单独诱变和等离子体-氯化锂复合诱变比较适合该菌株的诱变，等离子体诱变对于已衰退出发菌株具有活性代谢途径的激活作用.在实验中还采用了较方便的真菌单孢子平板直接诱变-筛选的方法，与传统的单孢子悬液诱变处理后再涂布平板分离菌落后筛选的方法相比，简化了工作环节、减轻了筛选的工作量;另外采用了一株具有DNA损伤修复基因缺陷的特殊大肠杆菌作为指示菌，有利于方便高效的追踪指示真菌代谢产物中的潜在抗肿瘤抗菌活性物质，这些方法也具有一定的新意.综上所述，本文为等离子体诱变技术用于海洋药源真菌育种的首例报道，其研究结果表明该技术作为一种较新颖的微生物育种技术，在海洋微生物药物研究方面具有很好的应用前景.当然，由于诱变育种工作工作量繁重，作为初步研究，本文在诱变条件及大规模诱变筛选方面还有待继续进行深入细致的工作.

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