基于代谢流量分布信息理解大肠杆菌中异柠檬酸裂解酶调节因子的代谢调控作用

柳志杰，周利，花强

华东理工大学 生物反应器工程国家重点实验室，上海 200237

基因的表达是通过不同的转录调节因子来调控的，转录调节因子是一类能结合在DNA特定序列上的蛋白。转录调节因子结合在DNA特定序列上就能促进或者抑制RNA聚合酶 (RNAP)的结合能力。RNA聚合酶 (RNAP) 亲和力的降低一般会降低基因的表达，而RNAP亲和力的提高一般会加强基因的表达。大肠杆菌中的异柠檬酸裂解酶调节因子 (IclR) 能够抑制 aceBAK操纵子的表达，aceBAK操纵子编码乙醛酸支路的3个酶：异柠檬酸裂解酶 (由aceA基因编码)、苹果酸合酶 (由 aceB基因编码) 和异柠檬酸脱氢酶 (IDH) 激酶/磷酸酶 (由aceK基因编码)。乙醛酸支路使得大肠杆菌能够在乙酸或脂肪酸上生长。乙醛酸支路是大肠杆菌在这些碳源 (乙酸、脂肪酸) 上生长时的必需途径，因为它避免了碳原子通过三羧酸循环而以两分子 CO2的形式失去。乙醛酸支路激活时，异柠檬酸在异柠檬酸裂解酶催化下裂解形成乙醛酸和琥珀酸，琥珀酸可以重新进入三羧酸循环，乙醛酸和乙酰辅酶A在苹果酸合酶的催化下形成苹果酸[1]。乙醛酸支路的第3个酶——异柠檬酸脱氢酶 (IDH) 激酶/磷酸酶具有双重功能，它通过磷酸化和去磷酸化异柠檬酸脱氢酶作用来控制异柠檬酸的流向[2]。

从上世纪90年代，代谢工程作为一门新的学科被提出以来[3]，代谢工程已经成当前国际生物技术领域的一个新的研究前沿。代谢流量分析作为代谢工程的一个主要的分析工具[3-4]，其结果是细胞内整个中心代谢途径的代谢速率，也即为流量。代谢流量分析可以用来阐明细胞的代谢网络和调控机制、提高生物生产过程的产量、注释未知的基因、分析药物的毒性等[5-8]。近年来，基于稳定同位素13C标记碳源的代谢流量分析方法已经成功地被应用于分析多种微生物，如大肠杆菌[9-12]、集胞藻[13]、酵母菌[14]和琥珀酸放线杆菌[15-16]等。

13C代谢流量分析实验流程为：在培养基中添加稳定同位素13C标记的底物，如首位13C标记的葡萄糖 (1-13C-glucose) 或均匀13C标记的葡萄糖 (U-13C-glucose) 等，当细胞代谢这些13C标记的底物时，底物上的同位素标记信息会随代谢反应从不同方向传递到代谢网络的各个中间代谢物上，进而传递到蛋白氨基酸上。菌体蛋白氨基酸含量丰富，提取方便，且这些氨基酸是由一些关键的中间代谢物合成的，根据它们的同位体分布信息可以推导得到中间代谢物的同位体分布信息[17]，并借助代谢流比率方法来进行代谢流量的定量解析[18]。

当前，对细胞的中心代谢途径基因的代谢调控研究得比较多，但对转录调节因子的代谢调控机理研究得则相对较少。本文主要应用13C代谢流量分析来研究iclR基因敲除对大肠杆菌BW25113生理和代谢的影响，进而揭示转录调节因子——异柠檬酸裂解酶调节因子在细胞代谢调控中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

E. coli BW25113、E. coli BW25113 ΔiclR，由华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室保藏。iclR基因敲除的大肠杆菌菌株 E. coli BW25113 ΔiclR是在原始菌E. coli BW25113染色体上敲除了iclR基因。

1.1.2 主要试剂及仪器

均匀13C标记的葡萄糖 (U-13C-glucose，pu＞99%)、首位13C标记的葡萄糖 (1-13C-glucose，p1＞99%)、N,N-二甲基甲酰胺和衍生剂N-叔丁基二甲基甲硅烷基-N-甲基三氟乙酰胺均购自 Sigma公司。其他试剂均为分析纯。高效液相色谱 (HPLC)为 Agilent 1200型液相。气相色谱质谱联用仪(GC-MS)为 Agilent 6890GC-5975MS型气质联用仪。酶标仪为BioTek Power Wave XS2型酶标仪。

1.1.3 培养基

培养基为M9合成培养基，其组成为：葡萄糖3 g/L，NH4Cl 1.0 g/L，(NH4)2SO42.7 g/L，Na2HPO46.8 g/L，KH2PO43.0 g/L，NaCl 0.6 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，维生素B1 1.0 μg/L，微量元素溶液 10 mL/L；微量元素溶液组成为：CaCl2·2H2O 0.55 g/L，FeCl3·6H2O 1.67 g/L，MnCl2·4H2O 0.10 g/L， ZnCl20.17 g/L，CuCl2·2H2O 0.04 g/L，CoCl2·6H2O 0.06 g/L，Na2MoO4·4H2O 0.06 g/L。

1.2 培养条件及标记实验

菌株均在37 ℃、220 r/min条件下摇瓶培养。摇瓶培养简单易行，在指数生长期，细胞快速地消耗营养源用于新细胞体的合成，胞内代谢物几乎没有积累，该时期的细胞代谢处于拟稳态过程，可以对这样的过程进行基于稳定同位素的代谢流量解析。标记实验用20% (质量分数) 均匀13C标记的葡萄糖和 80% (质量分数) 天然的葡萄糖或者20% (质量分数) 首位13C标记的葡萄糖和80% (质量分数) 天然的葡萄糖。菌株经过活化后接种于新鲜的M9合成培养基中。取指数生长中期的细胞用于细胞内流量分析和酶活性测定，实验重复3次，结果取平均值。

1.3 生理参数的确定

1.3.1 细胞浓度的测定

将发酵液适当稀释后于波长600 nm处测定吸光值OD600，通过OD600的变化来监测菌体生长情况。

1.3.2 细胞干重的测定

取一定量体积的发酵液，在4 ℃下12 000×g离心10 min，用去离子水洗2次后置于85 ℃烘箱中烘至恒重，称重。

1.3.3 葡萄糖的检测

HPLC检测。检测器：示差折光检测器；色谱柱：NH2柱；流动相：乙腈+水 (80∶20)，流速1 mL/min；检测器池温度：40 ℃；柱温：40 ℃。

1.3.4 有机酸的检测

HPLC检测。检测器：紫外检测器；色谱柱：ODS柱；流动相：0.1% H3PO4，流速：1 mL/min；柱温：40 ℃。

1.3.5 生理参数的计算

基于菌体浓度、葡萄糖浓度和有机酸浓度的变化，可以计算得到指数生长期细胞的比生长速率 (μ)、菌体得率 (YX/S)、底物的比消耗速率 (qS)和产物的比生成速率 (qP)[19]。

1.4 GC-MS样品的准备及分析

1.4.1 GC-MS样品的准备

收集指数生长中期的菌体细胞，用 0.9% NaCl溶液清洗3次，在200 μL 6 mol/L HCl 中105 ℃水解16 h。水解产物于60 ℃真空干燥烘干，加100 μL N,N-二甲基甲酰胺和50 μL N-叔丁基二甲基甲硅烷基-N-甲基三氟乙酰胺85 ℃衍生1 h，衍生化的样品过滤后用于GC-MS分析[12]。

1.4.2 GC-MS样品的分析

气相色谱柱：HP-5MS (30 m×0.25 mm× 0.25 μm)。升温程序：150 ℃保留2 min，以5 ℃/min升到180 ℃，然后以10 ℃/min升到260 ℃，保留 8 min；载气 (氦气，纯度≥99.996%) 流速为1 mL/min；进样量：0.2 μL；分流比：1∶100；进样口温度：250 ℃，离子源温度：230 ℃；−70 eV轰击；质谱仪扫描范围：70~560 m/z；溶剂延迟：5 min。

1.5 细胞代谢流量的定量计算

为了计算菌体细胞体内的代谢流量，我们根据大肠杆菌主要的中心代谢途径建立了大肠杆菌的代谢模型，包括29步代谢反应和24个代谢物。在这种情形下，此代谢模型为未定系统。为了模型可解，我们可以利用实验测得的代谢物同位体分布信息来分析代谢途径的流量比率，进而基于细胞代谢物的平衡式以及推导得到的代谢流量比率即可进行代谢网络反应流量的定量化分析[18]。

水解得到的蛋白氨基酸经过叔丁基二甲基硅烷化合物 (TBDMS) 衍生化处理，所得到的氨基酸衍生物就能够在气相色谱上得到很好的分离，在其后的质谱仪中，衍生化的氨基酸在电子轰击离子化作用下断裂成带有不同碳原子骨架片段的氨基酸碎片，并且这些碎片根据质荷比的不同而得到分离[20-21]。

对于质谱得到的每个带有不同碳原子骨架片段的氨基酸碎片，其质量分布矢量MDV可以通过公式1获得[22]。

m0表示不含13C标记的氨基酸碎片的丰度，mi>0表示i个碳原子被13C标记的氨基酸碎片的丰度。

由于自然界中各种元素的自然丰度会对得到的氨基酸碎片的质量分布矢量 MDVα产生影响。为了得到纯粹的氨基酸碳骨架的同位体质量分布矢量，MDVα需要校正掉衍生化氨基酸片段上的所有氢、氧、氮、硫、硅元素，以及衍生基团上的碳元素的自然丰度。这可以通过公式2进行校正[22]。

根据实验得到的氨基酸碎片的质量分布矢量我们即可计算出一些节点的代谢流比率。在本研究中，乙醛酸支路是关键的调控途径，Fisher等研究中仅给出了最终的计算式[23]，为了帮助理解，在这里给出其具体推导过程。目标代谢物OAA的C1到C4片段 (其质量分布矢量表示为OAA1_4) 在羧化反应中是由PEP的C1到C3片段和一分子 CO2得到 (其质量分布矢量表示为PEP1-3_CO2)， 在 乙 醛 酸 支 路 中 的 由 来(OAA_GOX) 一半为 ACA的 C1到 C2片段(ACA1_2) 和OAA的C1到C2片段 (OAA1_2) 得到 (即ACA1_2×OAA1_2)，另一半为ACA的C1到C2片段和OAA的C3到C4片段 (OAA3_4) 得到(即ACA1_2×OAA3_4)。因此能够得到下式：

PEP1-3_CO2的计算方法可以参考笔者的另一篇文章[18]。ACA1_2可以由丙氨酸的C2到C片段的质量分布矢量得到，OAA1_2可以由天冬氨酸的C1到C2片段的质量分布矢量得到，OAA1_可以由天冬氨酸的C1到C4片段的质量分布矢量得到，OAA3_4可以由OAA1_2和OAA1_4拟合得到。考虑OAA由乙醛酸支路得到的上限，OAA1_4PEP1-3_CO2和OAA_GOX之间的关系为：化简整理可得，来自于乙醛酸支路的OAA比率的上限为：

由得到的氨基酸片段的质量分布矢量 MDV可以计算得到中间代谢物的质量分布矢量MDV，由此可以计算得到中心代谢网络在关键代谢物节点处的代谢流比率。以这些流量比率数据为辅助限制条件，结合代谢物的质量平衡关系等[24]，由MATLAB即可定量计算出细胞中心代谢途径的代谢流量。

1.6 酶活性的测定

用于酶活测定的细胞裂解缓冲液组成：200 mmol/L Tris-HCl (pH 7)，4 mmol/L氯化镁和2 mmol/L二硫苏糖醇。

大肠杆菌酶液的制备：收集指数中期的细胞，4 ℃、12 000×g离心5 min收集菌体，用裂解缓冲液洗2次，然后悬浮在裂解缓冲液中，进行超声裂解，超声破碎条件：电压100 V，每超声3 s，间隔10 s，超声20次。超声裂解液在4 ℃、12 000×g离心5 min，上清液作为大肠杆菌粗酶液，测定上清液中的蛋白质浓度。上清液保存于−80 ℃的冰箱。

异柠檬酸裂解酶酶活性的测定[21]：反应基于异柠檬酸裂解酶催化的产物——乙醛酸和苯肼反应生成苯腙类物质，该物质在324 nm处有吸收峰。反应体系为100 mmol/L磷酸钾缓冲溶液(pH 7)、6 mmol/L氯化镁、4 mmol/L苯肼、12 mmol/L L-半胱氨酸和8 mmol/L异柠檬酸三钠。反应温度：30 ℃。

2 结果与分析

2.1 iclR基因敲除对菌株生理学特性的影响

大肠杆菌原始菌和突变株的生长特性见表1。

由表1可以看出，大肠杆菌原始菌和突变株的最大比生长速率分别为0.61 h−1和0.58 h−1，iclR基因的敲除使大肠杆菌的最大比生长速率下降了5%，同时降低的还有葡萄糖的比消耗速率、乙酸的比生成速率以及乙酸得率，下降幅度分别是7%、11%和7%。大肠杆菌原始菌和突变株的菌体得率分别为 0.35 g DCW/g葡萄糖和0.37 g DCW/g葡萄糖，相对于原始菌株而言，iclR基因的敲除使突变株的菌体得率略有提高。

2.2 iclR基因敲除对细胞网络中代谢流量比率的影响

大肠杆菌原始菌和突变株的部分TBDMS衍生化蛋白氨基酸的质量同位素分布见表2和表3。

表1 原始菌和突变株指数生长期的生长特性Table 1 Physiological characteristics of exponentially grown BW25113 and BW25113 ΔiclR

表2 大肠杆菌原始菌TBDMS衍生化蛋白氨基酸的质量同位体分布 (已校正)Table 2 Mass isotopomer distributions of E. coli BW25113 TBDMS-derivatized proteinogenic amino acids (corrected)

表3 大肠杆菌突变株TBDMS衍生化的蛋白氨基酸的质量同位体分布 (已校正)Table 3 Mass isotopomer distribution of E. coli BW25113 ΔiclR TBDMS-derivatized proteinogenic amino acids (corrected)

根据大肠杆菌原始菌和基因缺陷株的TBDMS衍生化的蛋白氨基酸的质量同位体分布，可以计算得到2种菌株细胞中合成若干关键代谢物节点的代谢途径的相对流量分布，也即代谢流比率 (图1)。

由图1可以看出，iclR基因敲除的大肠杆菌中丙酮酸由 ED 途径得到的比率(f_Pyr_from_ED) 显著增大、草酰乙酸由乙醛酸之路得到的上限显著变大、磷酸烯醇丙酮酸由戊糖磷酸途径得到的上限变小，而其他流比率变化不明显。丙酮酸由苹果酸得到的上下限均接近于零，说明在葡萄糖作为碳源的情况下，大肠杆菌原始菌和ΔiclR敲除菌中苹果酸酶催化反应的活性均极为低下。

图1 大肠杆菌原始菌和ΔiclR突变株的代谢流比率Fig. 1 Flux ratios at several key metabolic nodes in E. coli BW25113 and E. coli BW25113 ΔiclR. a: f_PEP_ from_glycolysis; b: f_Pyr_from_ED; c: f_OAA_from_ PEP; d: f_PEP_from_OAA; e: f_Pyr_from_Mal_ub; f: f_Pyr_from_Mal_lb; g: f_OAA_from_glyoxylate_ub; h: f_PEP_from_PP_ub; lb: lower bound; ub: upper bound.

2.3 iclR基因敲除对菌体代谢流分布的影响

为了了解 iclR基因敲除对大肠杆菌整个中心代谢途径的影响，可以基于所得到的代谢流比率结果、菌体的生理学参数以及细胞的代谢网络模型来计算整个中心代谢途径中的净反应流量，并以此解析相关代谢反应特性。

大肠杆菌原始菌和ΔiclR突变株的中心代谢流量分布情况如图2所示。

图2 原始菌和突变株的代谢流分布 (数值表示计算得到的净流量，其值以葡萄糖比消耗速率 (单位以mmol/(g DCW·h)) 为基准)Fig. 2 Metabolic flux distribution of E. coli BW25113 and BW25113 ΔiclR. The numbers are net fluxes determined. The flux values are expressed relative to the specific glucose uptake rate as indicated in parentheses (in mmol/(g DCW·h)).

由图2可以看出，iclR基因敲除大肠杆菌乙醛酸支路得到了激活，异柠檬酸分子有33%经乙醛酸支路分解得到琥珀酸和乙醛酸，流经 TCA循环的流比率变小，糖酵解途径流量比率变化不大，PP途径流比率变小，而草酰乙酸形成磷酸烯醇式丙酮酸的流量基本不变。

2.4 iclR基因敲除对菌体酶活性的影响

为了进一步确认 iclR基因敲除大肠杆菌乙醛酸支路是否得到激活，测定了乙醛酸支路关键酶之一的异柠檬酸裂解酶的活性 (图3)。由图可以看出，iclR基因的敲除成功地解除了对异柠檬酸裂解酶表达的抑制作用，从而使该酶活得到了显著提高，提高了60倍以上。

图3 大肠杆菌原始菌和突变株中异柠檬酸裂解酶活性的比较Fig. 3 Comparison of enzyme activity of isocitrate lyase in E. coli BW25113 and BW25113 ΔiclR.

3 讨论

为了阐明iclR基因敲除对大肠杆菌的影响，我们考察了糖酵解途径、戊糖磷酸途径、Entner-Doudoroff途径、三羧酸循环、乙醛酸支路在内的细胞中心代谢途径中的代谢流量分布情况，并同时测定了乙醛酸支路关键酶之一的异柠檬酸裂解酶的活性。综合以上得到的信息，为理解突变菌株的内在代谢调控特点和规律提供相应的理论基础。

有报道称乙醛酸支路的活性依赖于细菌的代谢状态，在一些碳源条件下，如葡萄糖和丙酮酸条件下，乙醛酸支路是不激活的[25]。另外，有文献报道通过酶活测定等方法得到：当 iclR 基因敲除时乙醛酸支路得到了激活[26-27]。然而，基于酶活性或代谢物分析等常规方法难以真正判断细胞内乙醛酸支路反应的的活跃程度[18]。本研究通过基于稳定同位素13C的代谢反应流量分析并结合酶活性测定，系统地确定了大肠杆菌原始菌在葡萄糖上代谢时乙醛酸支路活性的缺乏，而iclR基因的敲除有效地激活了大肠杆菌的乙醛酸支路反应，研究同时表明约有33%的异柠檬酸通过乙醛酸支路进行代谢。

在我们得到上述研究结果的同时，Waegeman等[28]分别利用均匀13C标记葡萄糖/天然葡萄糖 (20%∶80%，W∶W) 以及首位13C标记葡萄糖/天然葡萄糖 (50%∶50%，W∶W) 的混合葡萄糖作为底物研究大肠杆菌 K12 MG1655 ΔiclRΔarcA菌株在葡萄糖丰富培养基上的代谢，同样得到了乙醛酸支路被激活、30%异柠檬酸通过乙醛酸支路代谢，以及菌体得率得到很大提高等相似结论。

另有研究表明大肠杆菌在特定条件下会激活磷酸烯醇式丙酮酸-乙醛酸循环[29]。iclR基因敲除的大肠杆菌中，乙醛酸支路得到了激活，但研究表明草酰乙酸形成磷酸烯醇式丙酮酸的磷酸烯醇丙酮酸羧化激酶反应流量基本不变，说明 iclR基因的敲除不会明显影响未激活磷酸烯醇式丙酮酸-乙醛酸循环，碳原子没有过多地通过磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶反应以 CO2形式排出而得以保留。乙醛酸支路的激活，异柠檬酸通过TCA循环的相对流量变小，以及PP途径相对流量变小等使得CO2的释放量减少，另外，突变株乙酸的得率亦变小，这些原因就使得iclR基因敲除菌的菌体得率有所变大。

iclR基因敲除菌的乙酸关于葡萄糖的得率减小。大肠杆菌中乙酸产生的原因一般是“溢出代谢”[30]的结果，是由于葡萄糖的摄取及细胞生物合成和能量需要之间的不平衡造成的[31-32]。大肠杆菌可以通过降低葡萄糖的利用速率或者促进菌体的代谢来减少乙酸的产生[32]。突变株的葡萄糖比消耗速率较原始菌的小，另外，突变株乙醛酸支路的激活使得乙酰辅酶A的代谢效率更高，两方面的原因使得ΔiclR突变株的乙酸得率略低于原始菌株。

本研究通过基于稳定同位素13C的细胞内代谢反应流量定量解析，同时结合酶活检测等初步分析了转录调节因子异柠檬酸裂解酶调节子在大肠杆菌细胞代谢中的作用。该研究提供的利用代谢流量比率作为限制条件的代谢反应流量分析方法可以广泛地应用到更多的细胞体系和生物过程中，用以辅助对细胞特定基因功能以及代谢调控机理的阐明。

附录1 大肠杆菌中心代谢网络化学计量反应式Appendix 1 The central metabolic network in Escherichia coli with the stoichiometric reactions

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