尿足细胞标志蛋白Podocalyxin检测在糖尿病肾脏损害程度评估中的意义

程 亮，俞伟男，洪 兵，胡 文，郝海荣

糖尿病肾病 (diabetic nephropathy，DN)是糖尿病 (diabetes mellitus，DM)的主要慢性微血管并发症之一，其具体的发病机制目前尚未完全明确。近年来的研究提示肾小球足细胞损伤和脱落在DN肾小球滤过屏障通透性的改变及蛋白尿的发生发展中起着关键的作用［1］。因此，检测尿液中的足细胞及足细胞相关蛋白在DN的诊断中有重要意义。Podocalyxin(PCX)是肾小球足细胞足突顶端膜区的主要跨膜蛋白之一，也是足细胞表面特异性标志蛋白分子之一，在足细胞的成熟过程中固定于肾小球足细胞顶膜，参与维持肾小球的正常结构和滤过屏障。本研究通过检测肾小球足细胞PCX在2型糖尿病不同肾脏病变程度的患者尿液中的水平，评估PCX检测在DN诊断中的价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2010年6月—2011年5月在我科病房住院的2型糖尿病患者97例，其中男45例，女52例;年龄18～70岁;均符合1999年世界卫生组织 (WHO)糖尿病诊断标准;排除心、肝、肾脏疾病及各种感染性疾病，且近期未发生酮症酸中毒。按照24 h尿清蛋白排泄率 (urine albumin excretion rate，UAER)及血清肌酐 (SCr)水平将2型糖尿病患者分为4组: Ⅰ组，UAER＜30 mg/24 h，SCr≤135 μmol/L，27例，平均年龄 (53.19±8.15)岁;Ⅱ组，UAER为30～299 mg/24 h，SCr≤135 μmol/L，29例，平均年龄 (53.77±7.29) 岁; Ⅲ组，UAER≥300 mg/24 h，SCr≤135 μmol/L，22例，平均年龄 (54.31±7.93)岁;Ⅳ组，UAER≥300 mg/24 h，SCr＞135 μmol/L，19例，平均年龄 (54.27±8.63)岁。另选取2011年3—5月在我院体检的健康者30例作为正常对照组，其中男15例，女15例;平均年龄 (52.69±7.52)岁;均排除心、肝、肾等重要脏器疾病。各组受检者的性别构成及年龄间有均衡性。

1.2 方法

1.2.1 标本收集 所有受检者留取清晨第一次尿液10 ml(中段尿)，2 000 r/min离心10 min，弃上清，留取尿沉渣约200 μl，－20℃保存备用，用于尿液PCX定量测定;同一天开始留取24 h尿液，用于UAER和24 h尿蛋白定量的测定。

1.2.2 尿液PCX检测 用PCX单抗包被于酶标板上，标准品和样品中的PCX与单抗结合，加入酶标抗体，形成免疫复合物连接在板上，加入酶底物TMB，出现蓝色，加终止液，颜色变黄，用Varioskan Flash酶标检测仪在450 nm处测定吸光度，PCX浓度与吸光度呈正比，可求出样品中待测蛋白浓度。人足细胞标记蛋白PCX定量ELISA试剂盒由上海越研生物科技有限公司生产。

1.3 统计学方法 采用SPSS 15.0统计软件进行分析处理。计量资料以 ()表示，多组间均数比较采用单因素方差分析。相关性分析采用Spearman相关性分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组受检者一般情况及观察指标比较 与正常对照组比较，Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组、Ⅳ组患者糖化血红蛋白 (HbA1c)、PCX、UAER均显著增加 (P＜0.05)，Ⅱ组、Ⅲ组、Ⅳ组患者SCr、尿蛋白亦显著增加 (P＜0.05);与Ⅰ组比较，Ⅱ组、Ⅲ组、Ⅳ组患者糖尿病病程、PCX、UAER、尿蛋白显著增加(P＜0.05)，Ⅳ组患者HbA1c亦显著增加 (P＜0.05);与Ⅱ组比较，Ⅲ组、Ⅳ组患者糖尿病病程、PCX、UAER、尿蛋白均显著增加 (P＜0.05)，Ⅳ组患者 HbA1c亦显著增加 (P＜0.05);与Ⅲ组比较，Ⅳ组患者SCr显著增加，差异有统计学意义 (P＜0.05，见表1)。

2.2 糖尿病患者24 h UAER、24 h尿蛋白定量与尿液中PCX的关系 Spearman相关性分析显示，UAER与尿中PCX水平呈正相关 (r=0.78，P＜0.01，见图1);尿液中PCX与尿蛋白定量亦呈正相关 (r=0.58，P＜0.01)。

3 讨论

DN早期表现为肾小球内高压、高灌注、高滤过，进而出现肾小球毛细血管袢基底膜增厚和系膜基质增多，最后发展为肾小球硬化。临床预防DN患者肾功能恶化的关键在于强调早期发现、早期治疗。然而，临床用来评价肾脏损伤的指标如尿蛋白、SCr、微球蛋白、尿微量清蛋白等都有各自的局限性，并且这些指标受生理状态、病理状态、药物以及人为因素的干扰，影响其反映肾脏损伤的真实性［2］。

足细胞是高度分化的细胞，紧贴于肾小球基膜 (glomerular basement membrane，GBM)外疏松层，参与构成GBM的滤过屏障，是各种肾小球炎症及非炎症损伤的靶位［3］。目前，足细胞损伤在DN发生发展中的作用日益受到关注，足细胞的结构和功能蛋白也逐渐被人们所认识，其中PCX作为足细胞分化成熟的标志性蛋白最早被发现。PCX是CD34相关性唾液黏蛋白，由肾小球内皮细胞和足细胞合成，在足细胞成熟过程中固定于足细胞顶膜［4］。PCX通过 Na/H交换调控因子(NHERF2)/ezrin复合物对足细胞骨架形成和维持起重要作用;PCX同时也是肾小球主要带负电荷的蛋白分子，参与构成GBM的电荷屏障，通过电荷的排斥作用来维持足突间的空间结构，调节肾小球滤过屏障;并且，PCX还可阻止壁层细胞对足细胞的黏附［5］。正常肾小球通过分子屏障和电荷屏障几乎可以完全阻止血浆清蛋白分子的滤过，而足细胞PCX表达的减少将直接导致肾小球电荷屏障的阴离子分布减少，使得清蛋白更容易滤过;并且，PCX减少也影响足细胞裂隙隔膜正常结构的维持［6］。有研究发现，肾脏损伤后，尿液中检测到的PCX水平增加，同时伴随肾小球基底膜的损伤，足细胞顶膜区的PCX表达相应增加［7］。Hara等［7］研究证实肾脏损伤后，尿液中增加的PCX来源于足细胞顶膜区，而非脱落的足细胞碎片，表明尿液中PCX水平增加在肾脏损伤早期，早于足细胞从基底膜脱落以及足细胞损伤后活化的细胞膜脱落。

表1 糖尿病各组及正常对照组受检者临床资料比较 ()Table 1 Comparison of clinical data between DM groups and normal control group

表1 糖尿病各组及正常对照组受检者临床资料比较 ()Table 1 Comparison of clinical data between DM groups and normal control group

注:HbA1c=糖化血红蛋白，SCr=血清肌酐，PCX=足细胞标志蛋白podocalyxin，UAER=尿清蛋白排泄率;与正常对照组比较，*P＜0.05;与Ⅰ组比较，△P＜0.05;与Ⅱ组比较，▲P＜0.05;与Ⅲ组比较，☆P＜0.05

组别 例数 男/女 糖尿病病史(年) HbA1c(%) SCr(μmol/L) PCX(μg/L) UAER(mg/24 h) 尿蛋白(g/24 h)正常对照组 30 15/15 0 4.91±0.46 66.1±16.0 3.1± 0.5 11.3± 5.5 0.10±0.02Ⅰ组 27 15/12 3.52±2.66 9.17±1.81* 76.2±22.3 5.8± 1.0* 18.0± 8.6* 0.11±0.03Ⅱ组 29 13/16 7.57±1.97△ 9.37±1.51* 81.0±26.1* 15.3± 4.3＊△ 167.3± 76.9＊△ 1.71±0.96＊△Ⅲ组 22 10/12 8.92±1.43△▲ 8.93±1.38* 88.7±28.1* 28.9± 9.0＊△▲ 1 297.9±424.4＊△▲ 3.19±1.32＊△▲Ⅳ组 19 10/9 9.76±1.26△▲ 8.15±1.46＊△▲ 201.6±73.5＊△▲☆ 23.3±10.6＊△▲ 1 035.6±581.2＊△▲ 2.87±1.67＊△▲F 值0.17 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 4.26 47.60 59.72 51.14 85.31 107.57 56.84 P值

图1 糖尿病患者尿液中PCX与UAER的相关性Figure 1 Correlation between PCX and UAER in DM patients

本研究检测糖尿病患者与健康者尿液中PCX水平，发现糖尿病患者尿液中PCX水平显著高于健康者，表明足细胞表面PCX丢失可能与糖尿病肾脏损伤有关。按照UAER结果，将97例糖尿病患者分为4组，发现Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组患者尿液PCX水平逐渐升高，说明PCX水平随着糖尿病肾脏病变的进展有逐渐上升趋势，提示PCX水平与糖尿病肾脏病变进展相平行;然而，本研究发现PCX水平在Ⅳ组即DN发展后期出现下降趋势，考虑原因与DN发展后期肾小球足细胞大部分脱落，其残存足细胞明显减少，而且肾脏大部分肾小球硬化有关，提示PCX水平可反映肾脏损伤的程度，并可作为评估肾小球损伤的早期指标之一。UAER是反映DN早期肾损害的金标准，尿蛋白是公认的与肾脏疾病进展相关的独立因素，尿液中PCX水平与UAER及24 h尿蛋白定量均呈正相关，表明尿液中PCX水平可以间接反映DN患者肾脏损害的进展程度。

综上所述，肾小球足细胞表面标志蛋白PCX是判断糖尿病患者肾脏早期损伤的一项较为理想的指标，对于早期发现DN、评估肾脏损伤程度、监测DN进展和指导临床治疗有着重要的意义。

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5 Drossopoulou GI，Tsotakos NE，Tsilibary EC.Impaired transcription factor interplay in addition to advanced glycation end products suppress podocalyxin expression in high glucose－treated human podocytes［J］.AIP－Renal Physiol，2009，297(3):594－603.

6 Wolf G，Chen S，Ziyadeh FN.From the periphery of the glomerular capillary wall toward the center of disease:podocyte injury comes of age in diabetic nephropathy ［J］ .Diabetes，2005，25(6):1626 －1634.

7 Hara M，Yanagihare T，Kihara I，et al.Apical cell membranes are shed into urine from injured podocytes:a novel phenomenon of podocyte injure ［J］ .J Am Soc Nephrol，2005，16(2):408 －416.