幽门螺杆菌检测方法研究新进展

邵军丽，吴 丰

1.广东医学院公共卫生学院，广东东莞 523808;2.东莞中学松山湖学校生物科组

专题·幽门螺杆菌

幽门螺杆菌检测方法研究新进展

邵军丽1，吴 丰2

1.广东医学院公共卫生学院，广东东莞 523808;2.东莞中学松山湖学校生物科组

本文就近年来幽门螺杆菌检测方法新进展作一简要的概述，主要从细菌培养、快速尿素酶实验、组织学检查、尿素呼气实验、抗体检测、粪便抗原检测和分子生物学检测等几个方面展开。

幽门螺杆菌;检测方法;快速尿素酶实验;尿素呼气实验

幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，H.pylori)感染与慢性胃炎、胃溃疡、胃腺癌、胃黏膜相关性淋巴瘤有着密切的联系，在胃炎、胃溃疡、十二指肠溃疡和胃癌患者中H.pylori感染率约90%。世界卫生组织已把H.pylori列为第一类致癌因子，并明确为胃癌的危险因子。所以H.pylori感染的早诊断、早治疗十分重要和必要。H.pylori检测是H.pylori感染诊断的重要手段，本文就H.pylori检测方法近年来的发展作一概述。

1 细菌培养

一般用脑心浸液(或哥伦比亚琼脂或布氏琼脂)添加一定量的血清或全血，选择性抗生素做培养基，微氧条件培养3～5 d，根据菌落特征、涂片镜检、三酶(尿素酶、氧化酶、过氧化氢酶)试验判定为H.pylori阳性或阴性。

H.pylori在37℃保存需要每隔4～7 d传代才能保持其活力，而冻存的H.pylori复苏又有成功率低、时间长的缺点。Xu等［1］发现在布氏或脑心浸液琼脂培养基上将H.pylori深度穿刺，在37℃ 10%CO2条件下培养，无需传代即可以保持活力56 d。

2 快速尿素酶试验

快速尿素酶试验(rapid urease test，RUT)原理是H.pylori富含的高活性尿素酶可分解尿素产生氨，使pH升高，指示剂颜色发生改变。尽管尿素酶并不只是H.pylori所特有，但胃内存在尿素酶是H.pylori存在的证据之一。

一般在胃镜检查时，钳取近幽门处的胃窦黏膜活检标本置于RUT试剂中，5 min内即可通过颜色变化判定结果。传统的RUT试剂由2%尿素和酚红组成。Mclntosh等［2］优化了尿素的浓度和指示剂的种类，发现5%尿素和溴甲酚紫可以改善猪胃黏膜尿素酶活性的可视性。Hsu等［3］发现使用来自胃窦和胃体的双样本可以提高尿素酶检测的灵敏度。

3 组织学检查

一般将通过内镜钳取的活检标本立即用10%甲醛固定，然后进行常规包埋、切片、染色、水洗等操作，最后镜检。镜检下H.pylori可呈稍弯曲状、S状、短弧状、杆状、海鸥状。常用的染色方法有改良Warthin-Starry 银盐、改良 Giemsa、HE、Gimenez、石炭酸复红、免疫组化等。改良Warthin-Starry银盐染色法的敏感度100%、特异度95.6%，明显高于RUT和14C-尿素呼气试验(14C-urea breath test，14C-UBT)2 种方法［4］。刘莉等［5］比较了 HE、改良 Giemsa、免疫组化3种染色方法，结果是阳性率无显著性差异，但免疫组化时H.pylori菌体与周围组织对比度最强，最易识别。

放大内镜结合窄带成像技术(narrow-band imaging，NBI)能够精确观察消化道黏膜上皮形态，可以在内镜下即时观察预测H.pylori的感染，还可以预测胃炎的组织学严重程度和胃萎缩情况［6］。共聚焦激光显微内镜(confocal laser endomicroscopy，CLE)不仅能观察黏膜表面上皮形态，还可以观察到黏膜下组织形态，与NBI技术相比功能相同但诊断更精确。Ji等［7］利用CLE进行诊断，将胃黏膜表面具有白点、中性粒细胞和微小脓肿3种特征之一者诊断为H.pylori感染，诊断结果与常规组织学检查结果有很好的相关性，其准确度、灵敏度和特异度分别为 92.8%、89.2%、95.7%。

4 尿素呼气试验

哺乳动物细胞中不存在尿素酶，而且H.pylori是胃内具有高活性尿素酶的细菌，所以可以通过UBT测定尿素酶的活性间接检测H.pylori。检测前受检者口服同位素13C或14C标记的尿素胶囊，胃内H.pylori产生的尿素酶催化尿素迅速水解成NH4+和H13或H14，后者吸收入血液经肺以13CO2或14CO2形式呼出，收集呼气标本并测量13CO2或14CO2，根据绝对值或超基准值大小便可判断有无H.pylori的感染。

大多数的研究表明，13C-UBT的敏感性和特异性高于IgG和粪便抗原检测［8］。13C-UBT与RUT比较，敏感性的高低不一致，特异性上13C-UBT稍高［8］。

13C-UBT对于成人来讲是一个可靠的诊断方法，但对于儿童其准确性随年龄段不同而有变化。Leal等［9］将13C-UBT用于儿童的研究进行了系统回顾和Meta分析，结果表明，13C-UBT应用于＞6岁的儿童准确性较高、较稳定［(敏感度96.6%，特异度97.7%，阳性似然比(positive likelihood ratio，LR+)42.6，阴性似然比(negative likelihood ratio，LR－)0.04，诊断比值比(diagnostic odds ratio，DOR)1042.7］;13C-UBT 应用于≤6岁的儿童中准确性有些变动并且低几个百分点，尤其是特异度(敏感度95%，特异度93.5%，LR+11.7，LR－0.12，DOR 224.8)，但是准确性可以通过调整截断值、检测前进餐时间和尿素剂量来改善［9］。

Petrovic等［10］的实验表明，以80%超基准值为标准，与组织学检查法相比，14C-UBT敏感度94.5%、特异度100%、阳性预测值100%、阴性预测值96.3%、准确度97.8%。14CO2测试用的液体闪烁计数仪要比13CO2测试用的同位素质谱仪成本低，所以14C-UBT作为非侵入性的检测方法经常被用来测定儿童H.pylori的感染状况。如李红艳等［11］采用14C-UBT对武汉市3 368例儿童进行了H.pylori感染的临床分析。

由于14C-UBT有辐射，所以患者经常会有心理负担。实际上，受检者检测1次所摄入37 kBq(1 muCi)的14C-尿素，不及受检者1 d的自然本底照射剂量，而且几乎所有摄入的辐射量在72～120 h内都以尿和呼气的形式排出体外，所以14C-UBT是安全的，无需担心［12］。

5 抗体检测

H.pylori进入人体后会产生特异性抗体，通过对特异性抗体的检测可以间接证明病原菌的存在。目前已有很多成熟、便捷、效果较好的商品化H.pylori血清抗体检测试剂或试剂盒，所用技术有酶联免疫、化学发光酶免疫、胶体金免疫、免疫印迹等，所用抗原有重组蛋白、化学合成多肽等，步骤有一步的、多步的，功能有定性的、定量的，检测的抗体有H.pylori-IgG、尿素酶抗体、CagA抗体、VacA抗体、鞭毛蛋白抗体、热激蛋白抗体、外膜蛋白-67抗体等。如我国某公司2009年被批准生产的H.pylori尿素酶抗体检测试剂盒，采用双抗原夹心法免疫测定原理，结合胶体金免疫层析法即时检验技术，一步操作、肉眼观察、10～20 min出结果，是一种适合人群H.pylori感染筛查的快速体外诊断试剂盒，在国内得到了广泛的应用，如蒋斌［13］使用该试剂盒对2 998例健康体检人群进行血清H.pylori尿素酶抗体进行检测。

也有一些实验室在尝试建立新型抗体检测方法，如Stege等［14］利用磁性纳米珠作为H.pylori免疫亲和配体的固化载体、毛细管电泳分离、激光诱导荧光检测器检测，建立了35 min内即可完成的全自动在线定量检测H.pylori抗体的方法。

抗体检测的样本大多是血清或全血，但也有对其他样本检测的报道。Sonmezoglu等［15］用 ELISA来检测唾液的H.pylori-IgG，敏感度、特异度分别为87%、73%。Nguyen等［16］用试剂盒 RAPIRUN来检测尿液的H.pylori抗体，敏感度、特异度和准确度分别为79.5%、90.7%、84.5%。

6 粪便抗原检测

粪便抗原检测是一个方便、快捷、非侵入性、不需要特殊仪器，最重要的是取材方便的一种方法，尤其适用于小孩，近年来也获得广泛应用，如 Pourakbari等［17］用重组蛋白制备的兔抗烷基过氧化物还原酶(alkyl hydroperoxide reductase protein，AhpC)的多克隆抗体来检测粪便中AhpC蛋白。

Leal等［18］对基于小孩粪便 H.pylori诊断的文献做了系统回顾、Meta分析，结果表明单克隆抗体ELISA表现最好，敏感度97%、特异度97%、LR+29.9、LR－0.03;多克隆抗体ELISA次之，敏感度92%、特异度93%、LR+16.2、LR－0.09;单克隆抗体一步法检测再次之，敏感度88%、特异度98%、LR+17.1、LR－0.18。

7 分子生物学方法

7.1 核酸杂交 核酸杂交是用32P、或生物素、或荧光物质等标记H.pylori特异性的核酸探针，经过与生物样本原位杂交或与吸附样本DNA的膜杂交等程序来检测H.pylori。该技术是PCR技术广泛使用之前用的较多的一种分子生物学诊断方法，具有敏感性高和特异性强的优点，但操作繁琐。近年来的一个发展是用肽核酸来代替DNA作为基因的探针，因为肽核酸不仅具有核酸探针的功能，而且具有结构稳定、不被核酸酶和蛋白酶降解的特点。如Cerqueira等［19］用肽核酸-荧光原位杂交来检测悬浮培养的H.pylori的克拉霉素抗性，敏感度和特异度均为100%。

7.2 PCR方法 PCR方法测定 H.pylori的 DNA，具有简便、快捷、灵敏度高和特异性强的特点，不需要完整的细菌活体存在，所以它不仅可以检测胃的活检标本，也可以测定胃液、粪便、牙菌斑、水等其他离体标本，而且样品不需要严格的保存条件。所以PCR方法既适用于临床检测，又是流行病学调查的重要工具。随机扩增多态性DNA技术(RAPD)是一项较早应用的PCR检测技术，利用非细菌特异性的随机短链引物扩增，产生高度特异的片段，根据这些片段的组成来检测H.pylori。但这个方法首先要求培养分离出单一的菌株，增加了使用上的难度，所以以特定基因为目标的PCR技术更为常用，如普通PCR、Nested-PCR、Realtime PCR、PCR-RFLP等，作为扩增目标的特定基因有H.pylori的 RNA 基因(如 16S rRNA、5S rRNA、23S rRNA基因等)、尿素酶基因(如 ureA、ureB、ureC基因等)、VacA 基因、CagA 基因等。如 Kargar等［20］以 16S rRNA基因为目标的PCR来检测H.pylori的感染，以23S rRNA基因为目标的Real-time PCR来检测H.pylori的数量和克拉霉素抗性。CagA基因是一个重要的毒力因子，CagA阳性的菌株有更大的毒力，以该基因为目标的PCR可以对菌株毒力分型，如Saribas等［21］用PCR方法鉴定198个临床积累的H.pylori菌株，58.6%为CagA基因阳性。

Rasmussen等［22］通过胃活检、唾液和牙菌斑样本PCR和Southern blot实验表明，胃活检样本和口腔样本的H.pylori阳性存在正相关关系。牙菌斑中会有很多亲缘关系密切的细菌，所以目标基因和引物数量的选择对结果会有重大影响，如果检测时选择两个目标基因进行扩增就更为可靠［23］。

胃上皮细胞大约1～3 d会更新1次，脱落的上皮细胞会携带H.pylori-DNA随粪便排出，所以可以用PCR方法来检测。但是粪便含有Taq聚合酶的抑制剂-复合多糖［24］，难以从粪便中提取的DNA中彻底去除，使得相应的PCR检测的灵敏度仍不高［18］。Horemans等［25］最近提出了一种从粪便中提取DNA的新方法，可以有效减少样品DNA中混杂的复合多糖，即先用生物素标记的探针与粪便样本中的目标DNA杂交，然后用链霉亲和素包被的磁珠分离DNA，洗涤3次后可以直接用于普通或定量PCR检测;以感染H.pylori的沙鼠粪便为样本的实验表明，该提取DNA的方法与作为对照的商业化的DNA提取试剂盒相比灵敏度提高了10倍。

8 其他新方法

Ulanowska等［26］用固相微萃取-气质(SPME-GC/MS)分析发现，在H.pylori感染组所呼出的挥发性有机混合物(volatile organic compounds，VOCs)和悬浮培养的H.pylori所释放的混合气体中可以测到异丁烷、2-丁酮和乙酸乙酯等有机物，但在健康自愿者组所呼出的VOCs中检测不到，该方法可能发展为一个非常有用的非侵入性的检测方法。伏安生物传感器也被用在了 H.pylori的检测上［27］。

9 结语

综上，H.pylori的检测方法有很多，但各有优缺点。一般来说，培养最为可靠，应看作是H.pylori诊断的金标准，但是敏感性差，需要一定的设备，技术要求高、费时长、不能及时报告，一般不作为常规诊断方法;组织学检查也具有较高的诊断价值，但受H.pylori的灶性分布、取材、制片质量限制，容易出现假阴性，不适用于常规诊断;RUT实验简便、快捷、价格低廉，因而在临床上是侵入性检测中的首选方法，但非H.pylori尿素酶细菌可能造成假阳性［28］，H.pylori灶性分布及取材的限制可能造成假阴性;13/14C-UBT不需通过胃镜取材，不受胃内H.pylori灶性分布的限制，是追踪H.pylori治疗效果的可靠标准，但非H.pylori尿素酶细菌可能造成假阳性，并且13C尿素呼气试验所需质谱仪较昂贵，难于普及，而14C由于其放射性，不易被儿童和孕妇接受;血清学检测H.pylori抗体，不需通过内镜取材，具有简便、快速、结果重复性好、灵敏度高、特异性强、无需专用仪器和设备、成本低等优点，适用于大批量的流行病学调查，但不宜作为疗效判断指标，因为H.pylori根除后抗体水平3个月才开始下降，6～12个月尚难消失;粪便抗原检测也是一种较好的非侵入性检测H.pylori的方法，并且不需要特殊仪器、操作简便、耗时短、价廉、标本易于收集，在根除治疗4～6 d后H.pylori从粪便中消失，所以可作为抗H.pylori治疗后疗效观察的又一指标，但目前还未广泛应用;PCR技术敏感性高、特异性好，适用于研究和临床疗效判别，但需要专门的仪器。具体选用哪种方法就需要结合方法的特点、现有条件和检测目的等因素来选择。

［1］ Xu J，Czinn SJ，Blanchard TG.Maintenance of Helicobacter pyloricultures in agar stabs［J］.Helicobacter，2010，15(5):477-480.

［2］ Mclntosh KA，Krakowka S，Ringler SS，et al.In situ detection of ureasepositive Helicobacter pylori-like organisms on swine gastric mucosa ［J］.Can J Vet Res，2010，74(3):237-240.

［3］ Hsu WH，Wang SS，Kuo CH，et al.Dual specimens increase the diagnostic accuracy and reduce the reaction duration of rapid urease test［J］.World J Gastroenterol，2010，16(23):2926-2930.

［4］ Huang PN，Li XX，Huang CY.Improved silver staining of H.pylori in H.pylori detection［J］.Modern Preventive Medicine，2010，39(20):3905-3906，3909.

黄培宁，李旭祥，黄承乐.改良幽门螺旋杆菌银盐染色技术在幽门螺旋杆菌检测中的应用［J］.现代预防医学，2010，37(20):3905-3906，3909.

［5］ Liu L，Liu DL，Li C，et al.Comparison of three stainingMethodsfor detection of Helicobacter pylori in gastric biopsy specimens［J］.West China Medical Journal，2010，25(1):80-81.

刘莉，刘都礼，李佽，等.检测胃幽门螺旋杆菌三种染色方法比较［J］.华西医学，2010，25(1):80-81.

［6］ Tahara T，Shibata T，Nakamura M，et al.Gastric mucosal pattern by using magnifying narrow-band imaging endoscopy clearly distinguishes histological and serological severity of chronic gastritis［J］.Gastrointest Endosc，2009，70(2):246-253.

［7］ Ji R，Li YQ，Gu XM，et al.Confocal laser endomicroscopy for diagnosis of Helicobacter pylori infection:a prospective study［J］.J Gastroenterol Hepatol，2010，25(4):700-705.

［8］ Nocon M，Kuhlmann A，Leodolter A，et al.Efficacy and cost-effectiveness of the13C-urea breath test as the primary diagnostic investigation for the detection of Helicobacter pylori infection compared to invasive and non-invasive diagnostic tests［J］.GMS Health Technol Assess，2009，5:14.

［9］ Leal YA，Flores LL，Fuentes-Panana EM，et al.13C-urea breath test for the diagnosis of Helicobacter pylori infection in children:a systematic review and meta-analysis［J］.Helicobacter，2011，16(4):327-337.

［10］ Petrovic M，Artiko V，Novosel S，et al.Relationship between Helicobacter pylori infection estimated by14C-urea breath test and gender，blood groups and Rhesus factor［J］.Hell J Nucl Med，2011，14(1):21-24.

［11］ Li HY，Deng T，Zhan YJ，et al.Clinical analysis of Helicobacter pylori infection of 3368 children in Wuhan［J］.Chin J Gastroenterol Hepatol，2012，21(1):63-65.

李红艳，邓涛，占义军，等.3368例武汉市儿童幽门螺杆菌感染的临床分析［J］.胃肠病学和肝病学杂志，2012，21(1):63-65.

［12］ Pathak CM，Kaur B，Khanduja KL.14C-urea breath test is safe for pediatric patients［J］.Nucl Med Commun，2010，31(9):830-835.

［13］ Jiang B.Clinical Analysis of Helicobacter pylori infection of 2998 cases［J］.Journal of Modern Medicine ＆ Health，2011(18):2869-2870.

蒋斌.幽门螺杆菌感染率2998例临床分析［J］.现代医药卫生，2011(18):2869-2870.

［14］ Stege PW，Raba J，Messina GA.Online immunoaffinity assay-CE using magnetic nanobeads for the determination of anti-Helicobacter pylori IgG in human serum ［J］.Electrophoresis，2010，31(20):3475-3481.

［15］ Sonmezoglu M，Baysal B，Ergen A，et al.Detection and evaluation of salivary antibodies to Helicobacter pylori in dyspeptic patients［J］.Int J Clin Pract，2005，59(4):433-436.

［16］ Nguyen LT，Uchida T，Tsukamoto Y，et al.Evaluation of rapid urine test for the detection of Helicobacter pylori infection in the Vietnamese population［J］.Dig Dis Sci，2010，55(1):89-93.

［17］ Pourakbari B，Mirsalehian A，Maleknejad P，et al.Evaluation of a new antigen for diagnosis of Helicobacter pylori infection in stool of adult and children［J］.Helicobacter，2011，16(1):42-46.

［18］ Leal YA，Cedillo-Rivera R，Simon JA，et al.Utility of stool sample-based tests for the diagnosis of Helicobacter pylori infection in children［J］.J Pediatr Gastroenterol Nutr，2011，52(6):718-728.

［19］ Cerqueira L，Fernandes RM，Ferreira RM，et al.PNA-FISH as a new diagnostic method for the determination of clarithromycin resistance of Helicobacter pylori［J］.BMC Microbiol，2011，11:101.

［20］ Kargar M，Ghorbani-Dalini S，Doosti A，et al.Real-time PCR for Helicobacter pylori quantification and detection of clarithromycin resistance in gastric tissue from patients with gastrointestinal disorders［J］.Res Microbiol，2011，163(2):109-113.

［21］ Saribas Z，Demir H，Saltik Temizel IN，et al.Detection of cagA prevalence in clinical isolates of Helicobacter pylori［J］.Mikrobiyol Bul，2010，44(3):461-465.

［22］ Rasmussen LT，Labio RW，Gatti LL，et al.Helicobacter pylori detection in gastric biopsies，saliva and dental plaque of Brazilian dyspeptic patients［J］.Mem Inst Oswaldo Cruz，2010，105(3):326-330.

［23］ Chaudhry S，Idrees M，Izhar M，et al.Simultaneous amplification of two bacterial genes:more reliable method of Helicobacter pylori detection in microbial rich dental plaque samples ［J］.Curr Microbiol，2011，62(1):78-83.

［24］ Monteiro L，Bonnemaison D，Vekris A，et al.Complex polysaccharides as PCR inhibitors in feces:Helicobacter pylori model［J］.J Clin Microbiol，1997，35(4):995-998.

［25］ Horemans T，Deschacht M，Clais S，et al.An alternative，sensitive method to detect Helicobacter pylori DNA in feces［J］.Helicobacter，2011，16(2):113-118.

［26］ Ulanowska A，Kowalkowski T，Hrynkiewicz K，et al.Determination of volatile organic compounds in human breath for Helicobacter pylori detection by SPME-GC/MS ［J］.Biomed Chromatogr，2011，25(3):391-397.

［27］ Ly SY，Yoo HS，Choa SH.Diagnosis of Helicobacter pylori bacterial infections using a voltammetric biosensor［J］.J MicrobiolMethods，2011，87(1):44-48.

［28］ Brandi G，Biavati B，Calabrese C，et al.Urease-positive bacteria other than Helicobacter pylori in human gastric juice and mucosa［J］.Am J Gastroenterol，2006，101(8):1756-1761.

Development of detectionMethodsfor Helicobacter pylori

SHAO Junli1，WU Feng2
1.School of Public Health，Guangdong Medical College，Dongguan 523808;2.Biology Group，Dongguan Middle School-SSL School，China

In this artical we are mainly from several aspects included culture，rapid urease test，histology examination，urea breath test，antibody detection，stool antigen test and molecular biological detection.The development of detectionMethodsfor Helicobacter pylori was reviewed briefly in recent years.

Helicobacter pylori;DetectionMethods;Rapid urease test;Urea breath test

R573

A

1006－5709(2012)08－0691－04

2012-03-25

10.3969/j.issn.1006-5709.2012.08.002

广东医学院博士启动基金项目(XB1012)

邵军丽，博士，讲师。E-mail:shaojunli421@yahoo.com.cn