内质网应激中未折叠蛋白反应与非酒精性脂肪性肝病的研究进展＊

王 军 综述，陈东风 审校

（第三军医大学大坪医院野战外科研究所消化内科，重庆400042）

内质网（endoplasmic reticulum，ER）是真核细胞中重要的细胞器，它是由封闭的膜系统和膜围成的腔，形成互相沟通的三维网状结构。早在1945年，由Porter等学者在对培养的小鼠成纤维细胞进行电镜观察时发现并命名。它是蛋白质合成、折叠、组装、运输和细胞内钙储存的主要场所，同时参与脂质代谢和类固醇激素的合成。钙离子稳态的改变和未折叠或错误折叠蛋白质在内质网内的蓄积可以引发内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ERS）。ERS是细胞的一种自我保护机制，主要表现为蛋白质合成暂停、未折叠或错误折叠蛋白表达（UPR）和细胞凋亡等。

非酒精性脂肪肝病（NAFLD）是一种与胰岛素抵抗（IR）和遗传易感性密切相关的代谢应激性肝脏损害，其病理学改变与酒精性肝病（ALD）相似，但患者无过量饮酒史，疾病谱包括非酒精性单纯性脂肪肝（NAFL）、非酒精性脂肪性肝炎（NASH）及其相关肝硬化和肝细胞癌。NAFLD发病机制至今尚未完全明确，Day和James［1］提出的“二次打击”学说已成为解释该病发生机制的主要理论。初次打击主要指IR和脂质代谢紊乱所导致的肝细胞内脂质沉积，形成单纯性脂肪肝。二次打击主要指各种原因所致的氧化应激及脂质过氧化损伤，引起NASH。国内外相关研究显示，ERS与NAFLD的发生、发展密切相关，现将ERS与NAFLD的关系综述如下。

1 ERS及其诱发因素

当新合成的蛋白质N末端糖基化、二硫键形成以及蛋白质由内质网向高尔基体转运等过程受阻时，非折叠或错误折叠的新合成的蛋白质在内质网中大量堆积，或者是Ca2＋平衡状态的打破，都会损伤内质网的正常生理功能，称为ERS。根据诱发因素，ERS分为3种类型：（1）未折叠蛋白反应（unfolded protein response，UPR）；（2）正确折叠的蛋白质在内质网腔内过度蓄积激活细胞核因子κB（NF－κB）引发的内质网超负荷反应（endoplasmic reticulum－overload response，EOR）；（3）固醇调节级联反应。其中UPR与EOR是由蛋白质加工紊乱所致，后者则是在内质网表面合成的胆固醇损耗所致［2］。

2 未折叠蛋白反应

内质网应激发生初期，细胞通过改变其转录和翻译过程，减少蛋白的合成，降低进入内质网的蛋白量，同时上调内质网中分子伴侣和折叠蛋白的表达，增强内质网的蛋白折叠功能；细胞还可以通过上调内质网蛋白降解途径的相关基因表达，加速未折叠蛋白的降解过程。内质网产生的这种适应性反应，即UPR。这是一种在进化过程中保留下来、相对保守的应答，对机体具有保护作用。

蛋白质的正确折叠需要内质网中蛋白质分子的参与。其中主要有3类分子伴侣和折叠蛋白：热休克蛋白家族（HSP）的葡萄糖调节蛋白GRP78；外源凝集素类的钙联接蛋白（CNX）和钙网织蛋白（CRT）；蛋白二硫化物异构酶家族中的巯基氧化还原酶。这些伴侣蛋白能快速与转运入内质网管腔的新合成蛋白结合，参与新蛋白的折叠、寡聚化、成熟等翻译后修饰过程。其中葡萄糖调节蛋白GRP78在UPR过程中发挥了关键作用。GRP78又称免疫球蛋白重链结合蛋白（binding immunoglobulin heavy chain protein，BIP）。应激时，GRP78／BIP表达上调作用明显，所以是ERS和UPR激活的标志蛋白。

典型的未折叠蛋白信号途径：UPR需要3种内质网定位蛋白参与：肌醇需要跨膜蛋白激酶和核酸内切酶1α（IRE1α）、双链RNA依赖蛋白激酶样ER激酶（PERK）和活化转录因子6（ATF6）。以上3种应激感受蛋白都是内质网中的跨膜蛋白，都有各自的内质网腔结构域检测未折叠蛋白［3］。非ERS时，IRE1α、PERK和ATF6分别与GRP78／BIP结合处于不活跃阶段；应激时，GRP78／BIP从上述3种膜蛋白上解离，内质网腔中的未折叠蛋白聚集，导致细胞质内结构域二聚化，游离的IRE1α、PERK分别通过自身磷酸化而被激活。游离的ATF6进入高尔基体，通过蛋白酶水解成为活性转录因子［4］。上述分子伴侣表达上调可继续辅助未折叠蛋白的折叠，蛋白质折叠成原始的构象，经过修饰最终成为具有活性的功能性蛋白质。只有正确折叠的蛋白质，才能分泌进入高尔基体。如仍未正确折叠，则可进入细胞质中经泛素－蛋白酶体降解，这个过程称内质网相关降解（ERAD）。适度的内质网应激反应有利于细胞在各种外界因素的刺激下恢复细胞稳定，维持生存；过度或者持续应激则会启动细胞凋亡程序。

3 未折叠蛋白反应与NAFLD发生的关联通路

3.1 IRE1α－XBP1途径 IRE1α一个内切核糖核酸酶，通过非常规剪接XBP1信使RNA，激活 X－盒结合蛋白－1（XBP1），产生转录的UPR原件和内质网应激反应原件基因，控制ERAD和分子伴侣。IRE1α也降解信使RNA的许多分泌和跨膜蛋白，帮助减少进入ER的过载蛋白［5］。IRE1α介导酵母同源物ATF／CREB1（HAC1）mRNA剪接生成 HAC1p；IRE1α介导哺乳动物XBP1mRNA剪接生成XBP1s。下游途径中IRE1α激活靶点包括HAC1p和XBP1s［6］，同时 HAC1p和XBP1s分别是酵母和哺乳动物细胞膜脂质合成的关键因素［7－8］。研究证实：在NIH－3T3纤维母细胞中，只有对XBP1s增强表达，才能充分诱导内质网膜中最主要的磷脂成分卵磷脂的合成［9］。为研究小鼠出生后肝脏中XBP1的表达，Lee等［10］学者敲除小鼠表达XBP1的基因，血浆中三酰甘油、胆固醇和游离脂肪酸降低；分析小鼠的原代细胞，发现14碳醋酸生成脂肪酸和固醇类也是降低的，提示XBP1途径需要脂质更新。在饲养高蔗糖饮食的小鼠模型中，用染色质免疫沉淀法实验证实，XBP1也能结合生脂基因的启动子。有研究表明：在小鼠胚胎期3T3－L1纤维母细胞中，IRE1α－XBP1途径也与脂质合成有着密切的联系［11］。此外，有学者提出在胰岛素抵抗及高胰岛素血症条件下，UPR中IRE1α－XBP1途径能增加胰岛素诱导肝脏脂肪生成能力，胰岛素介导的蛋白合成与胰岛素介导的生脂过程紧密相连［12］。

3.2 PERK－eIF2α途径 内质网应激时，PERK蛋白在内质网膜寡聚化，随即诱导自身磷酸化，激活其激酶活性。募集真核生物起始因子2（eIF2）的α亚单位使eIF2α上的N端第51位丝氨酸磷酸化，导致蛋白质整体翻译水平弱化。PERK和eIF2α的磷酸化也能出现在脂质合成和脂肪肝的调控中，在小鼠乳腺上皮敲除PERK表达基因，游离脂肪酸减少和导致哺乳期小鼠生长迟缓［13］。eIF2α的磷酸化可以上调ATF4的表达，ATF4能上调CHOP、GADD34等蛋白的表达。有研究表明：ATF4杂合小鼠的表型包括避免年龄和饮食相关诱导肥胖和饮食诱导脂肪肝［14］。有学者利用GADD34的C末端活化碎片，在小鼠肝脏中，研究p－eIF2α信号调控作用［15］。转基因导致大量代谢性适应：包括在小鼠饲养高脂饮食中的脂质合成的降低。生脂基因核受体的低表达、过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）及上游的PPARγ的调控子，CCAAT／增强结合蛋白α和－β（C／EBPα和C／EBPβ）都与脂质合成的减少有关。

3.3 ATF6途径 ATF6是内质网上Ⅱ型跨膜蛋白，具有内质网腔内、跨膜区和胞质区3个结构域，N端位于胞质，含有一个碱性锌指结构（bZIP）的DNA转录激活功能域，C端位于内质网腔内，具有多个BIP结合位点。在正常状态下，ATF6和BIP形成稳定的复合物停留在内质网上。在内质网应激时，ER腔内的未折叠蛋白能使BIP和ATF6分离。ATF6以囊泡转移的方式从内质网膜转移到高尔基体，在高尔基体内被蛋白酶S1P（site－1protease）和S2P（site－2protease）切割后激活［16］。ATF6和固醇调节原件结合蛋白s（SREBPs）都是内质网膜结合转录因子，能通过蛋白水解的分裂作用被激活。现在已经发现肝脏有3种SREBP：SREBP－1a、SREBP－1c、SREBP－2。其中SREBP－1c在三酰甘油、胆固醇和脂肪酸形成中起着关键作用，它能控制脂肪细胞的分化和脂肪在细胞内的异位积聚作用。它能增加乙酰辅酶A合成酶的表达从而启动脂肪生成，并能抑制线粒体转运蛋白，促进TG正平衡，减少VLDL合成。肝脏SREBP－2过表达则使所有脂质生成酶的mRNA增加，其中HMCoA还原酶mRNA增加量最明显，而脂肪酸合成酶（FAS）的mRNA增加幅度相对较少。提示肝内SREBP1c是成脂基因表达的重要调控者。研究证实：核形成的ATF6抑制SREBP2的转录活性通过其SREBP2复合物，征募组蛋白HDAC1［17］。因此，UPR 三个重要传感器，PERK、IRE1α和ATF6α都能调控肝脏中脂质储存，都能与适当的下游蛋白或DNA相关蛋白结合发生作用。

4 未折叠蛋白反应和NAFLD的疾病进展

越来越多的证据表明，UPR在由NASH、糖尿病等代谢疾病引起的肝损害进展中起着关键作用［18］。NASH的肝脏病理学表现包括脂肪变性、炎症、纤维化、细胞凋亡和坏死［19］。国内外大量研究表明：胰岛素激活、氧化应激、细胞因子信号调控途径、炎症、细菌内毒素等因素之间相互作用可能与NAFLD进展有关，而UPR对NAFLD进展已有部分研究。

4.1 JNK 肥胖和胰岛素抵抗在NAFLD的病理学表现中起着重要的作用［20］。研究表明：肝脏和脂肪组织中的内质网应激在肥胖与胰岛素活性退化中起着分子连接作用［21］。肥胖诱导内质网应激通过UPR中IRE1α－JNK活化途径降低胰岛素信号，JNK－介导的胰岛素受体基底物（IRS－1）抑制物引起的胰岛素抵抗，其能促进肝脏脂肪变性，而同源蛋白3（TRB3）和JNK介导胰岛素抵抗能导致高胰岛素血症及肝脏脂肪生成的增加。在蛋氨酸－胆碱饮食喂养小鼠中敲除JNK1，保留JNK2，能降低肝细胞三酰甘油累积、炎症、肝损害和细胞凋亡［22］。此外，在肝细胞特定基因JNK1的消融表型中，能促进葡萄糖耐受不良、胰岛素抵抗及脂肪肝［23］。因此，UPR中IRE1α介导JNK途径，可能对NAFLD进展起着重要的作用。

4.2 氧化应激 内质网为蛋白折叠和二硫键的形成，提供良好的氧化环境。当氧化的蛋白折叠时，每一个二硫键形成生成一个活性氧。据估计分泌细胞每分钟生成300～600万个二硫键；因此，内质网中的蛋白折叠、活性氧的生成与氧化应激存在密切的联系［24］。细胞内氧化应激能破坏内质网稳态和诱导内质网应激。研究表明：UPR通过转录因子Nrf2能激活抗氧化过程［25］。Nrf2属于Collar家族亮氨酸拉链区转录因子，调控可诱导的抗氧化反应。Nrf2在肝脏和肾脏中高度表达，是UPR中PERK的亚基。研究表明：Nrf2删除导致蛋氨酸胆碱缺乏饮食小鼠中脂肪型肝炎的快速进展［26］。此外，Nrf2缺乏小鼠在内毒素、盲肠结扎、穿刺等因素引起的感染性休克中，死亡率增加［27］。上述研究已经表明：Nrf2可能参与先天免疫反应的调控。正如前面提到的，UPR中PERK介导eIF2α的磷酸化作用也导致ATF4的上调。因此PERK和Nrf2必然有维持细胞内谷胱甘肽水平的作用。由此推出：Nrf2与脂肪性肝炎有直接联系。除了PERK之外，最近也有证据表明UPR中IRE1α－XBP1途径也有抗氧化的调控作用［28］。

4.3 内毒素 NASH患者中小肠细菌过度生长，肠源性内毒素血症、肠黏膜屏障功能减退等肠道环境的改变可能在NASH的发病机制中起重要作用［29］。血清内毒素（LPS）可刺激肝脏产生肿瘤坏死因子（TNF）－α、白细胞介素（IL）－6等细胞因子，诱导炎性反应并引起肝脏坏死。同时，LPS能诱导正常状态下肝脏的UPR活化及肝脏硬化症小鼠肝脏中UPR的持续活化［30］。有研究证明，遗传性肥胖小鼠较无肥胖的对照小鼠，对LPS损伤具有更高的敏感性，在暴露于小剂量LPS下NASH 进展更快［31］。

4.4 细胞凋亡 NASH患者中肝细胞凋亡的增加与疾病严重程度有关，因此，细胞凋亡可能是NAFLD进展的组成部分［32］。如果UPR不能改善内质网应激则会导致细胞凋亡。C／EBP同源蛋白（CHOP）是 UPR中重要的促凋亡蛋白。CHOP表达在人和哺乳动物中受ATF4或ATF6调控，CHOP缺失可以避免内质网应激诱导的细胞凋亡。CHOP缺失在Akita小鼠中内质网应激介导糖尿病和胆汁淤积诱导的肝纤维化的衰减中表达延迟［33］。但是，NAFLD中CHOP的作用机制还不清楚，但最近有研究表明：在CHOP敲除小鼠中，蛋氨酸胆碱缺乏饮食没有诱导出肝损害［34］。

综上所述，NAFLD脂质来源包括饮食中乳糜颗粒残余物、释放脂肪组织中三酰甘油的游离脂肪酸以及新合成的脂肪组织。而ERS中的UPR途径与脂质合成的调控密切相关，且UPR严重度及其持续性与内质网应激密切相关，UPR能通过ERS快速重建或维持内质网稳态，从而抑制脂肪肝的发生。尽管如此，迄今为止对UPR信号通路的细节还不明确，还存在很多问题，比如UPR是如何从保护细胞生存反应转变为促凋亡反应，最终导致细胞死亡。UPR过程中是否还有一些未知的信号转导蛋白，而已知信号转导蛋白是否存在其它未知底物。另外，应该怎样设计UPR信号通路不同元件的基因缺陷动物模型，弄清各种疾病的发病机制，值得深入研究。

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