用于农药残留快速检测的酶生物传感器研究进展*

王明珠，徐 斐，曹 慧，于劲松

（上海理工大学食品质量与安全研究所，上海 200093）

0 引言

当前，农药的滥用对人类健康和环境产生很大威胁，传统的气相液相色谱检测方法准确可靠，适用于各种溶液的样品，不足之处在于检测设备昂贵、程序复杂、响应时间长、专业技术性强、检测成本高等。随着现代分析化学和微电子技术的提高，农药残留快速检测技术得到迅速的发展，酶生物传感器作为一种可以实时在线监测农残量的仪器具有较大的研究价值。

目前，对酶生物传感器的研究已较为广泛，信号转换元件已发展成熟，但生物敏感元件的选择性、灵敏度、检测限、稳定性、响应时间以及可重复性等仍影响着生物传感器的市场化应用，所以，达到实用化阶段的产品还较少［1］。本文针对酶生物传感器中使用较广泛的酶的种类、酶的固定化技术以及酶生物传感器在实际样品检测中的障碍和发展趋势做一概述，以便为后续研究提供参考。

1 检测用酶的种类

1.1 胆碱酯酶

胆碱酯酶（Cholinesterase，ChE）是检测有机磷类农药（organophosphate insecticides，OPs）广泛使用的酶，依其催化底物的特异性分为乙酰胆碱酯酶（acetylcholinesterase，AChE）和丁酰胆碱酯酶（butyrylcholinesterase，BChE），ChE对有机磷的检测是基于酶抑制原理。OPs使ChE磷酰化后降低了ChE催化底物的活性，通过比较有无OPs时酶催化底物水解的反应速率得到OPs对酶的抑制率，抑制率与OPs的浓度成一一对应关系，从而可以测得OPs的有无和浓度大小。

国内外学者在ChE筛选方面做过大量工作，实验表明:AChE和BChE对不同农药的检测限是不一样的［2］，此外，不同来源的同一种酶对农药的检测限也不同，余孝颖等人比较了家蝇、电鳐和鸡肝AChE对敌敌畏的检测限，表明家蝇 AChE 对敌敌畏的检测限最低，在1.1 ×10－7以下［3］，但家蝇的饲养困难，材料的获得受到限制。另有文献报道［4～6］，用肝脏组织和血清已经成功提取纯化出较高比活力的ChE，固定后对对氧磷和克百威的检测限分别为1.65 × 10－10和4.68 ×10－11。鉴于从动物肝脏和血清中提取ChE简便、快速、活力回收高、原材料丰富，是目前为止酶生物传感器中应用最广的ChE酶源。

除了动物来源的ChE外，纪淑娟等人从植物—猪腰豆幼苗中提取的AChE对敌敌畏、氧化乐果、灭多威的检测限均低于国标规定的允许残留限量，可以满足农药残留快速检测的要求［7］，目前，对其他植物ChE在生物传感器中的利用正在研发中。

综上所述，ChE用于检测OPs有诸多优点，如，来源广泛、便于提取、检测灵敏度高，检测限甚至能达到10－11，但是基于受农药抑制的酶为基础做成的生物传感器其固有缺点是:1）操作程序繁琐，需要预抑制时间;2）特异性较差，干扰信号多;3）不可逆抑制使酶活丧失严重。

1.2 有机磷水解酶

另外一种较常用的酶是有机磷水解酶（organophorus hydrolase，OPH），其检测原理是OPH能以OPs为底物催化水解其中的 P—O，P—F，P—S，P—CN 键产生酸和醇，从而导致反应体系中pH的变化，这种变化可以被转换成可测量的电或光信号，实现OPs浓度的测定。

OPH广泛分布于哺乳动物、昆虫和微生物体内，和ChE一样，来源于不同生物和同一生物不同组织的OPH水解OPs的种类和能力是不同的，其中微生物体内的OPH活性报道较多，国内外学者已从多种细菌、藻类、霉菌中分离筛选出OPH［8］，但由于OPH是胞内酶，提取技术尚不成熟，目前使用的OPH多提取自天然毕赤酵母菌株，但天然菌株中含量太低，生产成本高，这也是导致用OPH检测OPs研发较晚和进展缓慢的重要原因［9］。

以OPH为检测用酶做成的电流型传感器反映的是各种OPs的信号［10］，而电位型传感器仅反映能产生对硝基酚的OPs，Schöning M J据此原理设计的电流—电位型传感器可实现两类农药的区别检测，检测限在10×10－7级，为农药多残留检测提供了新的思路［11］。

OPH的优点是分析物本身即作为底物参与反应，不需要预抑制时间;只水解OPs，选择性强;检测中酶活损失少，可重复利用。缺点是OPH检测灵敏度普遍比ChE低，仪器核心芯片制作复杂，装置生产成本较高，且在天然毕赤酵母菌株中含量太低。

1.3 基因改造酶

前文介绍的2种常用酶应用于生物传感器上存在一定缺陷，比如:存在扩散阻碍、选择性低、对环境敏感、灵敏度低、检测限高、生产成本高等。为改善这些缺陷，近年利用基因工程技术生产较理想的新型生物酶成为研究热点。通过碱基替换、插入、剪切以及组合突变等方法［12～15］，已筛选出具有有机溶剂耐受性、选择性强等优势的ChE，此外，将OPH基因导入微生物体内并胞外表达得到的OPH也成功应用在酶传感器中［16］，大大降低了OPH的生产成本。

1.4 其他酶类

除上述提到的2种较常用的酶之外，还有一些酶类由于能被农药抑制而应用于酶传感器中，如，酪氨酸酶、碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、乙酰乳酸合酶、乙醇脱氢酶、谷胱甘肽转移酶［17～23］等。本文［24］比较了不同浓度的几种农药对商品AChE和自制鸡肝酶中总酯酶活力的抑制情况。结果表明:鸡肝中多功能氧化酶的存在使其具有更低的农药含量检出限，灵敏度与AChE接近且来源广泛、提取简便、价格低廉，是一种优良的农药检测用酶。

2 酶生物传感器中酶的固定化技术

酶生物传感器最主要的元件是固定化酶，因此，除了酶本身的性质外，酶的固定化技术一直是生物传感器研究的关键环节。它既要保持酶的固有特性，又要避免其应用上的缺陷。固定方法主要有以下几种:

2.1 交联固定法

交联法结合牢固，应用较多，交联剂使用最多的是戊二醛，实验表明:戊二醛熏蒸法与浸泡法相比得到的固定化酶膜较薄，且酶膜越薄，对农药的敏感度越高，检测限越低［25］。除戊二醛外，目前还有采用丙烯晴、聚乙二醇、双醛淀粉［26］等末端有功能集团的长链做交联剂的研究，这种柔性的交联剂可以减少酶在固定化过程中因刚性碰撞导致的失活，且提高了酶的固定化速度。

近年来有大量实验研究将AChE、有机磷水解酶、酪氨酸酶［10，18，27］等以戊二醛为交联剂固定在新型载体—纳米材料修饰的电极上，纳米材料具有良好的生物兼容性且活性极高，可以有效地促进酶和电极之间的电子传递［28］，大幅降低氧化还原反应的过电位，纳米材料以其独特的优势已成为酶生物传感器领域的研究热点。

2.2 包埋法

包埋法突出的优点是酶分子未发生化学反应，活力保持较高，且由于基质的保护作用，固定化酶的储存期较长，Andreescu S的实验结果表明:溶胶—凝胶法包埋AChE在－20℃可保存6个月，聚乙烯醇—苯乙烯吡啶包埋酶在4℃可稳定保存8个月。但凝胶网络形成的扩散阻力较大，只有小分子的底物和产物可以通过。适当控制包埋条件可减小这种扩散抑制，Sotiropoulou S等人［29］通过傅里叶变换红外光谱法和电化学阻抗光谱分析了AChE在溶胶凝胶中的流动机理，发现正硅酸乙酯与水混合比为1∶0.5时，固定酶膜疏水性最强，此条件下固定酶稳定性好、泄漏少、活性几乎没有损失，对底物响应只需约30 s，对敌敌畏检测灵敏度大大高于其他溶胶—凝胶固定酶制备的EBS。

2.3 结合使用法

为克服单一固定化方法的缺点，常采用2种或多种技术结合的方法，如吸附—包埋、吸附—交联、包埋—共价结合、共价—交联［30～32］等。Chough S H［33］先将 OPH 和牛血清白蛋白吸附于尼龙网上，再使用戊二醛熏蒸将酶与载体通过化学键连接，得到的固定化酶酶活保留率高且结合牢固，性质稳定。近年来，纳米材料的引入使得该方法具有广阔的应用前景［34］，纳米材料较高的酶富集效率使吸附在其上的酶量大幅增加，且由于纳米材料有极强的电子传递能力使交联后的固定化酶对底物和产物的响应较快。

2.4 其他方法

除上述较常用的固定方法外，酶的固定还有共价结合法和吸附法。共价结合法结合较牢固，但载体的活化过程很复杂，反应条件也较剧烈，要获得较高活力的固定化酶需要严格控制条件，因此，应用较少。吸附法固定条件温和，酶活保留率较高［35］，但制得的固定酶与载体相互作用力弱、容易脱落，因此，吸附法一般与包埋、交联等方法结合使用。

以上固定化方法涉及多点结合，分子排列的随机性导致酶的空间构型被破坏，使酶活性损失或产生扩散抑制等。针对上述问题，定向固定化技术（oriemed immobilization）发展起来。利用该技术制得的酶传感器对农药具有极高的敏感性和极低的检测限［36］，对氧磷的检测限达10×10－13，低于其他方法固定化酶的检测限，定向固定化技术刚起步不久，相关的研究也较少，但其优良的检测性能显示了该固定技术巨大的应用前景。

3 结束语

尽管国内外研究者在酶生物传感器领域做了诸多努力，其在农药残留在线分析应用上仍然存在一些缺点，例如:1）基于酶抑制原理制得的传感器选择性低，因此，目前的EBS检测只是针对加入单一农药标准溶液的样品，在实际样品中的应用很少;2）酶电极重复使用率低，再生较困难，且再生成本较高;3）检测限偏高，康天放［37］设计的酶电极在每次测定后简单抛光即可重新固定使用，重复使用率较高，但对乐果和克百威的检测限高于国家农残限量标准;4）农药提取率低，易造成假阴性结果，张淑平［38］以戊二醛交联固定AChE制成的传感器检测加标蔬菜中农药含量，检测性能优良，但回收率只有70%左右，而传统的气相色谱法接近100%;5）固定化酶还存在对有机溶剂耐受性差和储藏稳定性低等缺点。

尽管如此，酶生物传感器可以在线连续监测、预处理简单，具有传统的气相液相色谱法无法企及的的优势，仍不失为一种优良的检测农残的方法，正向着高度自动化、微型化与集成化的方向蓬勃迅速地发展。

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