高效液相色谱串联质谱法测定酱油中水解氨基酸

陈 媛 ，吴惠勤*，杭义萍，黄晓兰，黄 芳，朱志鑫，林晓珊，罗辉泰

（1.华南理工大学 化学与化工学院，广东 广州 510640；2.中国广州分析测试中心 广东省分析测试技术公共实验室，广东 广州 510070）

酿造酱油是以大豆或脱脂大豆、小麦或麸皮为原料，经微生物发酵酿制成的具有特殊色、香、味的液体调味液[1]。目前市场上出现了配制酱油和水解植物蛋白液[2]冒充酿造酱油的现象，为了鉴别酿造酱油与水解酱油，有人对酱油的香气成分、游离氨基酸以及水解酱油中的有害物质进行了研究[3-14]。但是针对酱油中的多肽的水解氨基酸的研究未见报道。酱油发酵过程中所产生的一系列极其复杂的化学反应，与微生物和生物化学有着密切的关系。其中，原料中的蛋白质在蛋白酶的作用下，水解生成胨、肽及氨基酸。但蛋白酶不能将所有的蛋白质都酶解为氨基酸，酿造酱油中还保留大量的中间产物——肽类等物质。而酸水解植物蛋白液是以含有食用植物蛋白的脱脂大豆等原料经盐酸水解，碱中和制成的液体调味液，制作过程一般原料用6mol/L盐酸在110℃条件下水解22h而成，水解反应过程剧烈，其中间产物——肽类的含量与酿造酱油不同。本研究旨在找出二者中间产物肽类的水解氨基酸含量和组成上的差异，为鉴别酿造酱油与水解酱油提供依据。现有文献报道的只有使用高效液相色谱或氨基酸自动分析仪检测酱油中的游离氨基酸，目前还没有人做过使用HPLCMS/MS检测酱油中肽类的氨基酸组成的研究。而HPLCMS/MS的优势在于采用“母离子>子离子”的多反应检测模式（MRM），大大提高检测的灵敏度和选择性，而且可针对不同化合物同时选择多对不同的检测离子，实现多组分同时检测的目的。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

天然发酵酱油原油（不含任何添加剂），酸水解植物蛋白液：广东珠江桥生物科技股份有限公司提供。氨基酸对照品谷氨酸、天冬氨酸、脯氨酸、丝氨酸、丙氨酸、甘氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、精氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、赖氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、半胱氨酸、色氨酸：购自Sigma公司；盐酸、正丁醇、甲醇、乙醇（分析纯）：广州化学试剂厂；乙腈（色谱纯）：德国Merck公司；实验室用水为双蒸水。

1.2 仪器与设备

Agilent 1200LC/6410B MS液相色谱/串联四极杆质谱联用仪，由二元梯度泵、自动进样器，柱温箱，Thermo BDS HYPERSIL C18色谱柱组成；胜谱实验电热板；DHG-9041A型电热恒温干燥箱：上海精宏实验设备有限公司；XW-80A旋涡混合器：江苏海门市麒麟医用仪器厂；TDZ5-WS平衡离心机：湖南赛特湘仪。

1.3 实验方法

1.3.1 样品处理方法

多肽物质提取及水解：分别取5mL样品水浴80℃条件下蒸干，加入10mL 70%vol乙醇超声，振荡，4000r/min离心5min，倒掉上清液，沉淀加入5mL70%vol乙醇重复洗涤一次，倒掉上清液，沉淀用氮气挥干乙醇，用16mL 6mol/L盐酸溶解，装入20mL的顶空进样瓶，抽真空充氮气，加入3滴重蒸苯酚。110℃于恒温干燥箱中水解22h。水解后样品过滤到烧杯中，电热板80℃蒸干盐酸，加5mL双蒸水，取1mL定容至50mL。

水解氨基酸衍生化：水解得到的溶液100μL于2mL进样瓶中，80℃氮气水浴吹干，加入50μL 2.5mol/L盐酸正丁醇，压盖，涡旋混匀，80℃衍生40min，取出后氮气吹干，加1mL80%乙腈水溶液涡旋1min，过0.20μm有机滤膜，HPLC-MS/MS测定[15]。

1.3.2 分析条件

色谱条件：Thermo BDSHYPERSILC18色谱柱（150mm×2.1mm，2.4μm），流动相A为10mmol/L甲酸铵（含0.2%甲酸），B为乙腈。梯度洗脱程序：0～5min，0%～40%B；5.1min～7min，40%～80%B；7min～8min，80%～0%B；8min～12min，0%～0%。流速0.2mL/min；进样量：1μL；柱温：30℃。

质谱条件：电喷雾离子源，正离子电离模式，干燥气（N2）温度为350℃，雾化气（N2）压力为275.8kPa，干燥气（N2）流量10.0L/min，电喷雾电压4000V，扫描方式为多反应监测（MRM）模式，质谱分析参数见表1。

表1 氨基酸的质谱分析参数Table 1 HPLC-MS-MS parameters of amino acid

1.3.3 标准溶液配制

准确称量氨基酸对照品用0.1mol/L盐酸溶解配制成含每种氨基酸200mg/L（其中谷氨酸和天冬氨酸浓度为400mg/L），再稀释成1mg/L、0.5mg/L、0.1mg/L、0.01mg/L、0.001mg/L系列浓度，按1.3.1衍生化方法进行衍生，上机。

1.4 计算公式

标准曲线法计算水解氨基酸含量：

2 结果与讨论

2.1 沉淀多肽的溶剂及其浓度的选择

试验了30%vol、50%vol、70%vol、90%vol乙醇和70%vol甲醇作沉淀剂沉淀多肽的效果，其总离子流图见图1，由图1看出，70%vol乙醇沉淀出的多肽的水解氨基酸峰高最高，证明70%vol乙醇沉淀出的多肽最多，实验效果最好。沉淀后的多肽在水解前用5mL70%vol乙醇溶解，按1.3.1的方法相同条件下进行衍生，得到酿造酱油和水解酱油空白样。其与多肽水解氨基酸的总离子流图见图2，结果证明，70%vol乙醇基本能把除多肽以外的游离氨基酸洗掉，没有游离氨基酸的干扰，得到的沉淀物是不溶于70%vol乙醇的多肽，其水解后得到的氨基酸完全是组成多肽的氨基酸。

图1 30%vol，50%vol，70%vol，90%vol乙醇与70%vol甲醇作沉淀剂峰面积图Fig.1 Peak area of 30%vol，50%vol，70%vol，90%vol ethanol and 70%vol methanol precipitate

2.2 方法的精密度，线性范围，检出限和定量限

按1.3.3方法测定得氨基酸对照品的峰面积，以峰面积为Y值，氨基酸质量浓度为X值对数据进行线性回归，结果表明在0.001mg/L～1.0mg/L浓度范围内，16种氨基酸的峰面积和浓度呈良好的线性关系，相关系数R2为0.998以上。精密取6份天然发酵酱油原油，按1.3.1样品衍生方法处理上机，测定方法的精密度，结果表明，各氨基酸的RSD在1.05%～8.88%范围内。16种氨基酸的相对标准偏差，回归方程，按3倍信噪比计算方法的检出限和按10倍信噪比计算方法的定量限（S/N=10）见表2。

2.3 多肽的水解氨基酸的含量及相对百分含量

图2 70%vol乙醇沉淀水解油后的空白样(a)，沉淀天然酿造酱油原油的空白样(b)，FSS(c)和HVP(d)的多肽水解氨基酸总离子流图Fig.2 TIC of 70%vol ethanol blank sample of HVP (a) and FSS (b),FSS (c) and HVP (d) hydrolyzed amino acids in peptide

表2 16 种氨基酸的相对标准偏差，回归方程，检出限和定量限Table 2 The relative standard deviation of 16 kinds of amino acids,the regression equations,limit of detection and limit of quantitation

由天然酿造酱油原油和酸水解植物蛋白液的多肽的液相色谱-质谱总离子流图，选择MRM模式，提取16种氨基酸的检测离子，各色谱峰经质谱母离子、子离子，相对保留时间定性，氨基酸对照品定量，分别得到16种水解氨基酸的含量，计算其相对百分含量，结果见表3。

表3 天然发酵酱油原油和水解植物蛋白液水解氨基酸含量及其相对百分含量Table 3 Hydrolyzed amino acids content and the relative content of FSS and HVP

由表3可以看出，天然发酵酱油原油中组成多肽的水解氨基酸总量约是酸水解植物蛋白液的10倍，FSS中多肽的总量为2378.76mg/L，HVP中多肽的总量为247.57mg/L。其中FSS中组成多肽必需氨基酸的总量是700.68mg/L，占总氨基酸的29.46%。HVP组成多肽的必需氨基酸的总量是60.33mg/L，占总氨基酸的24.37%。说明天然发酵酱油原油的营养价值远远高于酸水解植物蛋白液。从组成多肽的水解氨基酸的总量可以区分天然酿造酱油和酸水解植物蛋白液。

对各种水解氨基酸的质量浓度进行比较，FSS中排名前五位的水解氨基酸分别为谷氨酸、天冬氨酸、亮/异亮氨酸、赖氨酸、丝氨酸，其质量浓度分别为462.29mg/L、437.63mg/L、245.99mg/L、158.50mg/L、157.16mg/L。HVP中排名前5位的水解氨基酸分别为谷氨酸、天冬氨酸、亮/异亮氨酸、丙氨酸、脯氨酸，其质量浓度分别为62.08mg/L、35.12mg/L、24.93mg/L、22.94mg/L、19.66mg/L。从组成多肽的水解氨基酸的含量可知，FSS和HVP的水解氨基酸含量差异较大，其中谷氨酸和天冬氨酸所占比例最多，这与原料中组成蛋白质的氨基酸比例有很大关系，有研究表明，大豆蛋白质中谷氨酸和天冬氨酸含量最多，蛋氨酸、半胱氨酸、色氨酸含量很少[16-17]，另外色氨酸在酸水解条件下会和含醛基的化合物（如糖）作用生成黑色物质而被破坏掉，蛋氨酸、半胱氨酸含有硫原子，水解的过程也很容易被氧化掉，所以FSS和HVP的水解氨基酸中都未检测到蛋氨酸、半胱氨酸、色氨酸。酱油中的肽多为酸性肽，酱油中的多肽显味性远远低于游离氨基酸，但是肽能增强酱油味道的厚度和延长味的持续性，在烘托游离氨基酸的鲜味、甜味、苦味表现上十分重要。亮氨酸和异亮氨酸是同分异构体，相对分子质量相同，都是131.2g/moL，与正丁醇酯化后加上一个酯基，分子量增加57，所以其检测离子对都是188>86，又因为其极性相同，在本文色谱条件下同时出峰，实际检测到的是2种氨基酸的含量，所以其质量浓度比较大，在FSS和HVP中都排在第三位。赖氨酸是人体的第一必需氨基酸，在人体新陈代谢过程中发挥着重要的作用，由于谷物食品中的赖氨酸含量甚低，且在加工过程中易被破坏而缺乏，故称为第一限制性氨基酸。天然发酵酱油原油中赖氨酸在多肽中的含量21倍高于酸水解植物蛋白液，其中FSS中赖氨酸的含量为158.50mg/L，HVP中赖氨酸的含量为7.56mg/L。所以可以从组成酱油多肽的赖氨酸的含量分析区分天然酿造酱油和酸水解植物蛋白液。

FSS多肽中赖氨酸、组氨酸、酪氨酸相对百分含量约是HVP的2倍。FSS多肽中赖氨酸、组氨酸、酪氨酸相对百分含量分别是6.66%、2.24%、3.02%，而HVP多肽中这3种氨基酸相对百分含量分别是3.05%、1.18%、1.12%。HVP中丙氨酸、脯氨酸相对百分含量约是FSS的2倍。HVP多肽中丙氨酸、脯氨酸相对百分含量分别是9.26%、7.94%，FSS多肽中这2种氨基酸相对百分含量分别是5.76%、4.56%。以上表明FSS和HVP中个别氨基酸的相对百分含量存在数量上的倍数关系，鉴于此可以从单个水解氨基酸的相对百分含量鉴别天然酿造酱油和酸水解植物蛋白液。

3 结论

本实验通过使用HPLC-MS/MS方法分别对天然发酵酱油原油和酸水解植物蛋白液中的多肽的水解氨基酸的含量和比例进行了研究，除蛋氨酸、半胱氨酸、色氨酸未检出外其他16种氨基酸均得到很好的检出。实验结果表明FSS中的多肽总量约为HVP的10倍，其中多为酸性肽，谷氨酸和天冬氨酸的占比接近40%。FSS中的赖氨酸、组氨酸、酪氨酸相对百分含量是HVP的2倍。其中FSS中赖氨酸的含量为158.5mg/L，是HVP的21倍，所以赖氨酸可以作为一种特征氨基酸判定是否为水解植物蛋白液。本研究也为质检系统对酱油的检测提供新的思路。

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