新型核酸分子荧光探针
——分子信标的研究进展

余丽丽，姚 琳，杨黎燕，李仲谨

(1.西安医学院药学院，陕西 西安 710021；2.陕西科技大学化学与化工学院，陕西 西安 710021)

1952年Chargaff发现了碱基互补配对原理，1953年Watson和Crick在此基础上提出了DNA双螺旋模型，这两大发现既是生物分子识别史上最重大的发现，又是核酸分子荧光探针分子信标(Molecular beacon，MB)的理论基础。许多分子生物学和核酸化学合成的研究突破都得益于MB的发展，从20世纪60年代初至今，MB已被广泛地应用于生物、药物、化学等多个领域[1～3]。近年来，MB特别是基于DNA结构的MB，已成为一种重要工具，用于核酸的复制、重组、翻译和表达的研究。为了满足后基因组时代的发展需求，人们通过各种分子工程策略，发展了许多敏锐性更高、选择性更优的MB。

作者在此对MB的结构、设计原理、热力学研究、选择性与动力学研究进行了综述，并对非典型MB(LNA-MB、SQ-MB)进行了介绍。

1 MB的结构

1996年，Tyagi和Kramer首次共同提出了MB的概念。MB是一种单链寡核苷酸探针，具有独特的茎环状(也称发夹型)结构，其结构一般包括4个部分：(1)环状区(Loop)：一段长度为15～30个碱基的目标识别区域，可与待测核酸序列互补配对，达到识别的目的；(2)茎干区(Stem)：两段长度为5～8个碱基的互补序列；(3)荧光基团：一般连接在MB的5′-端，常见的荧光基团是荧光素(Fluoresein)；(4)猝灭基团：连接在MB的3′-端，常见的猝灭基团有Dabcyl、BHQ-1和BHQ-2(图1)，基于以上猝灭基团的猝灭效率在85％～97％之间。

图1 常见的荧光猝灭基团

2 MB的设计原理

在没有检测序列时，MB构成一个茎-环结构(Stem-Loop)，荧光基团和猝灭基团彼此紧邻，荧光基团将外界给予的大部分能量传递给猝灭基团，猝灭基团吸收能量后以热的形式散发；少部分未被猝灭基团吸收的能量通过发射荧光释放，此过程即为荧光共振能量传递(Fluorescence resonance energy transfer，FRET)[4～6]，常将此时的结构称为发夹结构，如图2所示。

图2 MB的设计原理

在检测序列时，MB的发夹结构打开，猝灭基团与荧光基团有效分离，荧光得以恢复，Loop段与检测序列形成比发夹结构中的Stem双螺旋结构更长、更稳定的杂交双螺旋结构。

大多数MB的设计都基于FRET，该情况下大量的能量传递都不以光的形式释放，而是通过非辐射途径——热的形式释放，有效地提高了猝灭效率，降低了背景噪音。

3 MB的热力学研究

大部分情况下，MB与目标分子的杂交可以用热力学系统解释。一个简单的开/关模型可近似描述反应的最初和最终状态。该模型可通过实验数据支持：当MB与检测序列完全互补时，形成的双螺旋结构解旋温度(T0)为42 ℃；而当检测序列中有1个碱基错配时，形成的双螺旋结构解旋温度(Tm)在28～31 ℃之间。该模型描述了检测序列中1个碱基错配对检测序列与MB形成的双螺旋结构Tm的影响：错配碱基位置与Loop中心区域越接近，对Tm的影响越大，Tm与T0的差距也越大[7～9]。

MB和线性DNA/RNA探针在热力学上的研究不仅说明了Tm和选择性之间的关系，同时也解释了为什么MB比线性DNA/RNA探针的选择性更强。首先，线性DNA/RNA探针有2种可能存在的状态：自由态、与检测序列互补形成双螺旋结构[10]；而MB有3种可能存在的状态：与检测序列杂交形成双螺旋结构(Phase 1)、发夹结构(Phase 2)、随机盘绕结构(Phase 3)，如图3所示。

图3 MB在体系中的3种不同状态

MB的选择性取决于完全互补的检测序列-MB形成的双螺旋结构的解旋温度(T0)与1个碱基错配的检测序列-MB形成的双螺旋结构的解旋温度(Tm)的差异性。热力学研究表明，MB在发夹结构的自由能低于在随机盘绕结构的自由能[7,8,10～13]，这意味着，杂交最易发生在温度改变引起的双螺旋结构相变到发夹结构过程中，而未过渡到随机盘绕结构之前。Stem螺旋结构越长，完全配对的双螺旋结构和含错配碱基的双螺旋结构的解旋温度差别越大，MB的结构越稳定、选择性越优。

4 MB的选择性与动力学研究

相对于线性DNA/RNA探针，MB表现出较优的选择性，这得益于MB的发夹结构，此外，MB还可通过优化序列提高它的选择性[8，14]。热力学研究表明，通过增加Stem的长度和稳定性可以有效地提高选择性，而提高选择性的最简单方法则是增加Stem序列中G、C的含量。但是，随着MB中Stem螺旋结构稳定性的提高，它的杂交速率会有所减慢。线性DNA探针长度为17～19个碱基时，它的杂交速率常数在1×104L·mol-1·s-1左右；但是MB的Stem长度从4个碱基增加到6个碱基时，杂交速率常数从5000 L·mol-1·s-1降到40～300 L·mol-1·s-1[8]，如图4所示。

图4 杂交速率与Stem长度的关系

Stem序列长度缩短，会导致背景噪音的增大和选择性的下降。通常来说，Stem序列长度在5～7个碱基之间、Loop长度在15～25个碱基之间，能使选择性和杂交速率常数都维持在可接受范围。因此，平衡Stem序列长度缩短带来的选择性降低和Stem序列长度增长带来的杂交速率常数降低这二者的矛盾，是研究者面临的一个挑战。其中一种策略是使用更长的Stem序列(Stem序列包含与目标序列结合的Loop序列部分)，该方法可以实现杂交速率的加快，且不需牺牲特殊增长的Stem序列。

选择性与杂交速率的矛盾还受温度的影响。在MB的实际应用中，温度是一个重要的外在影响因素。较高的温度会使自由的MB从发夹结构转变到随机盘绕结构，在随机盘绕结构时，MB的荧光恢复，带来背景噪音。实际应用过程(如活体成像、即时PCR检测)中，温度一般高于25 ℃。当温度高于50 ℃时，发夹结构开始转变到随机盘绕结构，此时，它们作为无效的MB同时还引入较高的背景噪音[8,10]。因此，MB需要稳定的Stem结构以减少被检测到的背景噪音荧光[4，15]。现阶段，已经发展了一些新型的温度稳定型Stem系统解决了这个问题。

5 非典型MB介绍

5.1 锁核酸分子探针(LNA-MB)

为解决温度过高引起发夹结构转变为随机盘绕结构而引起较高的背景噪音的问题，研究人员合成了锁核酸(Locked nucleic acid，LNA)MB。LNA中的核糖是一个双环呋喃糖结构，此结构使得碱基与核糖之间的链接键不能随意转动，分子的稳定性更高(图 5)。而且LNA-DNA杂交能力比DNA-DNA杂交能力更强[16～18]，所以LNA-MB的选择性也明显强于DNA-MB。在95 ℃时，RNA或DNA都已经发生变性，但LNA-MB能够保持稳定的发夹结构，且LNA-MB与目标DNA仍能保持杂交状态。因此，LNA-MB被广泛应用于普通DNA-MB不适用的高温生物学研究。

图5 LNA-MB的结构

5.2 超级猝灭基团分子探针(SQ-MB)

SQ-MB是一个一端具有多个猝灭基团的荧光分子探针，如图6所示。

图6 包含有3个猝灭基团的SQ-MB

近年来，MB被广泛地应用于生物技术研究的各个领域。但由于MB结构中的荧光基团不能被有效地猝灭，较高的背景噪音严重影响了实际应用过程中测试结果的准确性。因此，通过结构的优化以降低体系的背景噪音越来越受到关注。据报道，应用多个猝灭基团与一个荧光基团配对，可以有效地提高猝灭效率。这是由于多个猝灭基团可以提高吸收效率、增强猝灭基团与荧光基团间的偶极-偶极配位能力，从而提高猝灭效率[17]。

6 结语

MB是近几年发展起来的一种新型检测技术，具有高灵敏度、高选择性等优点，广泛应用于分子生物学、生化分析等诸多领域。今后，MB的主要发展方向为：(1)其它形态(如哑铃型)MB的设计合成和研究；(2)三螺旋结构的MB的探讨研究；(3)通过猝灭基团的设计和研究，以降低背景噪音。

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