智舌快速检测水产品中的麦氏弧菌

陈春艳，窦文超，田师一，王珍英，楼芳芳，赵广英

智舌快速检测水产品中的麦氏弧菌

陈春艳，窦文超，田师一，王珍英，楼芳芳，赵广英*

(浙江工商大学食品与生物工程学院，浙江 杭州 310035)

探索仿生传感器——智舌在麦氏弧菌快速检测中的可行性，以期构建一种新型的水产品中致病性弧菌的快速检测技术。用智舌结合主成分分析法对11种致病性弧菌的液体培养物进行区分，以确定该法能否将11种致病性弧菌区分开及其所需的最短培养时间，并确定针对被测物的适宜电极和频率段组合；然后用智舌结合簇类独立软模式识别法构建麦氏弧菌的判别模型，并对判别模型进行回判及验证，根据判别准确率确定最佳判别模型，从而探索智舌结合簇类独立软模式识别法能否用来建立快速检测麦氏弧菌的数据库。结果显示：当弧菌在其特异性培养基中培养7h后，智舌能很好地将11种致病性弧菌区分开；6种电极与其频率段组合下的判别模型对所有样本的判别准确率均达到了100%。说明所建模型可用于麦氏弧菌的快速筛检。

智舌；麦氏弧菌；簇类独立软模式识别法；快速检测

致病性弧菌是污染水产品最主要的病原菌，该类菌是许多国家进出口水产品的必检项目。麦契尼可夫弧菌(Vibrio metschnikovii)简称麦氏弧菌，于1981年由Jacqes等首次分离得到，是国内外学者公认的12种致病性弧菌之一[1]。近年来各地陆续有从被感染病人、食品和饮用水源中分离到麦氏弧菌的报道[2-3]。据美国疾病控制中心(centers for disease control，CDC)肠道细菌及弧菌研究室报道，麦氏弧菌主要来源于水源、水产品、人类血液、尿液等，主要引起人类伤口感染和败血症，其危害性已引起有关研究机构的密切关注[4]。

目前，电子舌已广泛应用于酒类、饮料、食品的品质评定等领域[5-10]，但在微生物检测方面尚处于起步阶段，国内外仅有少数几篇报道[11-16]。例如2003年等[12]采用基于脉冲伏安法的电子舌良好地区分了6 种不同的微生物：一种酵母菌，两种细菌和三种霉菌；2004年Legin等[14]采用由8个交叉敏感的传感器和一个标准pH电极组成的电位型电子舌分析模拟的典型的黑曲霉发酵溶液，结果显示，电子舌能同时测定混合培养基中的铵、柠檬酸盐和草酸盐，精密度良好(误差8%)；2010年Jorge等[16]构建出利用电子舌同时检测内毒素和其他细菌溶解性污染物的新方法。智能型电子舌(简称智舌)是一种新型电子舌，其是以传感器阵列检测样品信息，结合模式识别以及专家数据库对被测样品整体性状进行分析的现代化仪器[17]。与其他国家开发的电子舌不同，智舌采用组合脉冲弛豫谱技术，使得其具有适用范围广、检测速度快、响应谱信息量大、传感器使用寿命长等优点。

不同种类的微生物所含酶系统及其代谢途径不尽相同，所以在一定容积的培养基中，随着微生物的生长，液体培养物的整体性状就会具有菌种的明显整体特异性。而智舌能够很好鉴别被测液体样品的整体综合信息。本实验设计将两者结合，初步探讨用智舌结合主成分分析法及簇类独立软模式识别法(soft independent modeling of class analogy，SIMCA)法，以麦氏弧菌为被检菌，创建一种新型的食品微生物快速检测技术。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

1.1.1 菌种

麦氏弧菌(Vibrio metschnikovii) MCCC 1H00048 (Vme1)、拟态弧菌(Vibrio mimicus) MCCC 1H00078(Vmi)、辛辛那提弧菌(Vibrio cincinnatiensis) MCCC 1H00030 (Vci)、河流弧菌(Vibrio fluvialis) MCCC 1H00045(Vfl)、创伤弧菌(Vibrio vulnificus) MCCC 1H00066(Vv)标准菌株 国家海洋局第三海洋研究所；弗尼斯弧菌(Vibrio furnissii) CGMCC 1.1613(Vfu)标准菌株 中国普通微生物菌种保藏管理中心；麦氏弧菌(Vibrio metschnikovii) ZJGSMC 1ME0901(Vme2)、ZJGSMC 1ME0902(Vme3)、ZJGSMC 1ME0903(Vme4)、ZJGSMC 1ME0904(Vme5)、霍利斯弧菌(Vibrio hollisae) ZJGSMC 1H0907(Vh)、海鱼弧菌(Vibrio damsela)ZJGSMC 1D0901(Vd)、副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus) ZJGSMC 1P0901(Vp)、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)ZJGSMC 1A0803(Va)、鲨鱼弧菌(Vibrio carchariae)ZJGSMC 1C0903(Vca) 浙江工商大学食品安全快速检测实验室和食品微生物实验室。

上述各试验用菌株在本研究进行之初都用生化反应系统——API 20E或弧菌科生化鉴定管进行菌种的鉴定确认。

1.1.2 培养基

所用培养基为本实验室自主研发的麦氏弧菌选择性鉴别培养基(简称为VmeDM)，其配方为：蔗糖20g、酵母浸出粉5g、氯化钠10g、胆酸钠3g、牛胆粉5g、硫代硫酸钠10g、柠檬酸铁1g、美蓝指示剂0.05g、琼脂20g、蒸馏水1000mL，pH(8.0±0.2)。

1.1.3 仪器

智舌由浙江工商大学食品与生物工程学院感官实验室研制开发，为传感器阵列、多频脉冲扫描仪和电脑3部分组成的一种仿生传感器。智舌的电极组阵列采用标准的3电极系统，直径为Φ2mm的铂电极、金电极、钯电极、钛电极、钨电极及银电极作为工作电极，1mm× 5mm的铂柱电极作为辅助电极，参比电极为Ag/AgCl电极，外盐桥使用饱和KCl，通过六通道多频大幅脉冲信号激发采集装置使工作电极逐个对溶液进行多频大幅脉冲伏安法扫描[18]。

智舌是在Winquist的脉冲伏安型电子舌的基础上，对其激励信号进行了改进与扩充，增加了1、10、100Hz的脉冲频率段。多频脉冲的激励方式，使三电极体系在反映物质不同电势下电化学特征的同时，还呈现了物质在不同频段下的响应征。特别是对于混合物质体系，由于不同的物质组分在不同频率下有各自特定的响应信号，多频脉冲伏安法比常规脉冲伏安法能够提供更大量的检测信息量。智舌相较于电位型电子舌的优点在于电极不需要修饰，可循环使用；除了具有普通伏安型电子舌使用寿命较其他电子舌寿命长，操作简单性能稳定易智能化、使用寿命长和成本低廉等独有的特点外，它提取的有效信息量成倍的增多，增强了电子舌的辨识能力，尤其是在基体成分复杂的液体样品更具优势。

1.2 方法

1.2.1 实验样品的制备

菌株的标准培养液：将菌株制成大约为1.5×106个细菌/mL的标准培养液。

区分鉴别组样品培养液的制备：所需菌种为Vme1及其他10种弧菌。分别取100μL的11种弧菌的标准培养液转种于盛有50mLVmeDM的锥形瓶中，每种弧菌配制4份菌悬液，37℃条件下同批摇床培养(转速160r/ min)。每隔1h取出一批培养液(每批培养液含11种致病性弧菌，每种弧菌4份菌悬液，共44份菌悬液)，水浴100℃/20min灭活待测。

模式识别单元组训练集及检验集样品培养液的制备：所需菌种为Vme1、Vme2、Vme3及其他10种弧菌。分别取100μL上述14株弧菌的菌悬液转种于盛有50mLVmeDM的锥形瓶中，37℃条件下同批摇床培养(转速160r/min)8h后，水浴100℃/20min灭活待测。其中，实验样本包括训练集和验证集，Vme1、Vme2、Vme3各培养12个样本作为训练集，Vme4及其他10种菌各培养6个样本，作为检验集。

未知样品的制备：所需菌种为Vme4、Vme5及其他10种弧菌。分别取100μL上述12株弧菌的菌悬液转种于盛有50mLVmeDM的锥形瓶中(Vme4、Vme5各配制12份菌悬液，其他10种菌各培养8份菌悬液)，37℃条件下同批摇床培养(转速160r/min)8h后，水浴100℃/ 20min灭活。由非实验者进行编号，并记录相应的编号对应的菌种名称。实验者在不知样品名称的情况下用智舌检测。

1.2.2 检测方法

智舌所应用的多频大幅脉冲伏安法在l、10、100Hz脉冲下采集样品的电化学信息，仪器的采集速率为每隔0.001s采一个点，对于采集的数据要选取特征值即每个相应电流脉冲信号提取其最大、最小和两个拐点共4个值组合进行分析。多频脉冲伏安法是以常规脉冲伏安法作为基元模式，增加了不同脉冲频率段上的阶段性变化，减短了常规脉冲伏安法的脉冲时间间隔。这不仅可以消除各个频率间响应迟滞的干扰，而且使智舌大大地增加了采集的信息量，具有特异性和非特异性体系均可适用、响应速度快、响应谱信息量大、适宜智能化的特点，能够更好地反映微生物在液体培养基里的综合信息[7]。

多频脉冲参数设置为：起始电位1V；终止电位－1V；电平步进100mV；数据库Access；基准电压：1.235V。

将每个样本的菌悬液分成相等的3份，智舌通过传感器阵列分别用同样的方法对这3份菌悬液进行检测分析，3次检测结果得到3个行向量，对行向量求平均得到的数据即代表这一样本的检测结果。

1.2.3 分析方法

1.2.3.1 PCA法

智舌对致病性弧菌的区分鉴别研究采用主成分分析法(principal component analysis，PCA)法作为数据处理方法。提取电流采集信号的最大值、最小值和拐点值作为检测样品的变量，以行向量代表样品，纵向量代表变量，把不同电极不同频率段的数据分别保存成数据表格，进行主成分分析。比较不同电极及频率段的主成分得分图，在二维和三维平面上比较各个电极在不同频率段下对样品的示踪、区分效果，最终确定适宜的电极及其脉冲频率段组合用于监测目的菌生长状况、区分不同致病性弧菌。数据处理软件采用SPSS 11.0。

1.2.3.2 SIMCA模式识别法

智舌结合SIMCA法构建麦氏弧菌的智能模式识别单元采用SIMCA法作为其数据处理的方法。模式识别是化学计量学中定性分析的方法，即将样本集按样本的某种性质(通常是隐含的)进行分类及特征选取[19-20]。本实验中，SIMCA判别模型的建立主要有两个步骤，第一步是对培训集样本的智舌数据进行PCA分析，为每一个类建立一个PCA模型，即聚类；第二步以检验集样本去拟合PCA模型，用辨别率和预示率来评价模型的好坏。数据处理软件：Unscrambler V9.1。

2 结果与分析

2.1 智舌对致病性弧菌的鉴别

在保证准确性的基础上，为尽量在短时间内得到鉴别11种致病性弧菌的检测结果，本研究用智舌分别对培养1、2、3、…、24h的致病性弧菌液体培养物进行鉴别研究，再采用PCA对智舌采集的数据进行处理，得到各电极及频率段组合的主成分得分图，对其进行分析、比较区分辨识效果，确定能够将致病性弧菌区分开的最短时间及最佳的电极及频率段组合。结果显示，当实验菌株在特异性培养基中培养7h后，智舌的W电极(1、10Hz)、Ag(10、100Hz)、Au(100Hz)、Pd(100Hz)能够很好地区分11种致病性弧菌液体培养物(图1)。

图1 智舌对11种致病性弧菌的主成分得分区分效果图Fig.1 PCA score plot of 11 pathogenic vibrios distinguished by Smartongue

11种致病性弧菌都能被很好地区分开，且麦氏弧菌普遍与其他10种致病性弧菌的距离较远。分析原因可能是本实验使用的培养基为麦氏弧菌的特异性培养基，内含蔗糖、硫代硫酸钠及美蓝，麦氏弧菌能利用蔗糖产生小分子有机酸，有机酸与硫代硫酸钠等共同作用，会降低培养基的氧化还原电势；而其他致病性弧菌皆氧化酶阳性，副溶血性弧菌和辛辛那提弧菌弧菌不能分解利用蔗糖，其他弧菌受到美蓝抑制作用，表现为不生长或生长很弱。故麦氏弧菌对培养基的改变情况与其他菌对培养基的改变有显著性差异，从而进一步扩大了麦氏弧菌液体培养物的菌种特异性。

综上所述，当实验菌株在麦氏弧菌特异性培养基中培养7h后，智舌能很好地区分11种致病性弧菌。本实验证明了智舌对该培养物的敏感性。

2.2 智舌结合SIMCA法构建麦氏弧菌的智能模式识别单元

2.2.1 麦氏弧菌PCA判别模型的建立

在本实验中，取培养7h后的弧菌液体培养物作为研究对象，因为2.1节的实验结果表明当弧菌在麦氏弧菌的特异性培养基中培养7h后，智舌能够很好地将11种致病性弧菌区分开。

如1.2.1节所述，Vme1、Vme2、Vme3各培养12个样本作为训练集，用于建立PCA判别模型，Vme4及其他10种菌各培养6个样本，作为评价判别模型是否有效的检验集。首先利用智舌检测样本培养液，得到菌悬液的整体综合信息，提取电流采集信号的顶点值和拐点值作为被测样品的变量值进行主成分分析，通过交互验证建立麦氏弧菌的PCA模型。电极阵列有6种不同的电极，每种电极又有3个频率段，扫描结果共18个组合，即18个PCA模型。首先由图2筛选得到相对较好的PCA模型，再用训练集和检验集样本回判及验证PCA模型，从而确定最佳模型。

图2 麦氏弧菌的银电极10Hz PCA 模型Fig.2 PCA model of Vibrio metschnikovii (Ag electrode in 10 Hz)

图2A显示了样本点分散和差异，具有相同或相近性质的样本聚集在一起，而差异较明显的样本相互远离。图2B表示各样本点对相应PCA模型的影响程度，由样本点的杠杆值和残差来决定。杠杆值是样本点或变量在模型中投影点距模型中心的距离，表示的是单个样本或变量与模型中其他样本或变量的区别，和样本点或变量对建立的模型的影响程度，值越大表示对模型的影响越大。残差是样本点或变量的观察值与拟合值之差，表示了模型未能解释的样本点或变量的特征的量，其值越小模型拟合越好。因此，样本在主成分排序图中散开，且样本点的残差值和杠杆值都较小，表明模型中训练集选取的样本具有代表性, 各模型拟合性较好。

2.2 PCA模型的回判与检验

SIMCA是一种有监督模式的识别方法，属于二值判定方法，即样本特征的判别结果只有两种——是或否。本实验的目的是建立麦氏弧菌的快速检测方法，故将实验所用到的菌株分为两类，即“是麦氏弧菌”和“不是麦氏弧菌”。PC A模型是否有效，需要用训练集和检验集样本拟合PCA模型，根据判别准确率来评价模型的好坏，这时就需要用到识别率与拒绝率。所谓识别率就是考察某类样品有多少落在该类模型的区域内；而拒绝率是考察某类样品模型对于其他不属于该类的未知样品的拒绝程度，即是否落在该类模型的区域外。如果PCA模型对同类样品的识别率及对其他类样品的拒绝率均达到100%，就表明PCA模型正确可靠，可用于判别分析未知样本。

图3 麦氏弧菌在银电极10Hz频率段下的PCA模型对训练集和检验集样本的判别结果Fig.3 Score plots for discrimination between Vibrio metschnikovii and other Vibrio species in training set and testing set by PCA model based on Ag electrode and 10 Hz

用训练集样本——Vme1、Vme2、Vme3(PCA模型是利用这些数据建成的)和检验集样本——Vme4及其他10种治病性弧菌的样本数据去回判PCA模型。图3为回判结果，纵轴是样本距模型的距离(S2/S0)，值越小表示对应的分类模型能更好的描述样本，样本属于该类的可能性高；横轴为样本杠杆值；图中分别用一条垂直线和一条水平的直线给出了样本到模型的距离和杠杆值在α＝0.05显著水平下的域值，如图3中两直线与坐标轴构成的区域即为麦氏弧菌的有效区域，即落入该区域的样品就被判别为麦氏弧菌。麦氏弧菌在银电极10Hz频率段下的PCA模型对训练集样本和检验集样本的判别结果为：训练集样本Vme1、Vme2、Vme3均落在了该模型的有效区域内(共36个样本)，即识别率为100%，说明该模型能完全识别训练集的自身类样本；检验集样本Vme4落在了该模型的有效区域内(共6个样本)，即识别率100%，检验集样本Vv、Vca、Va、Vp、Vci、Vmi、Vd、Vh、Vfu、Vfl均落在模型的有效区域外(共60个样本)，即拒绝率100%，说明该模型能完全识别检验集中的自身类样本，拒绝其他类样本。

表1 麦氏弧菌的PCA模型对训练集和检验集样本的判别率Table 1 Discriminantion rate of training set and proving set discriminated by the PCA model of V. metschnikovii

如表1所示，麦氏弧菌在W(1、10Hz)、Ag(10、100Hz)、Au(100Hz)、Pd(100Hz)电极下的PCA模型能准确地识别同类，拒绝他类，其判别准确率均达到了100%，说明所建模型正确可靠，可用于未知样品的归类检测。

图4 麦氏弧菌在银电极10Hz频率段下的PCA模型未知样本的判别结果Fig.4 Scores plot of unknown samples discriminanted by the PCA model of V. metschnikovii (the Ag electrode in 10 Hz)

2.3 SIMCA判别模型对未知样本的检测

为进一步证明SIMCA判别模型的有效性，用表1中判别准确率达到100%的判别模型对未知样本进行判别。本实验中用于检测的未知样本共有104个，其中麦氏弧菌24个样本，其他致病性弧菌共80个样本点。结果发现各模型对未知样本的判别准确率也均达到100%，说明表1中判别率为100%的模型是麦氏弧菌的最佳判别模型，可以用来快速筛检麦氏弧菌。图6为麦氏弧菌的银电极10Hz判别模型判别11种致病性弧菌共104个样本点的结果，所有样本均被准确判别，没有错判。

3 结 论

智舌是一种以多频大幅脉冲伏安法为基元模式的新型智能电子舌，与常规电子舌相比，智舌包含的有效信息量成倍增多，特别是对于混合物质体系，由于不同的物质组分在不同的频率下会有各自特定的响应信号，因此智舌能够更全面更真实地反映样品混合物质体系的整体特征。本研究首次将智舌引入到麦氏弧菌的快速检测中，通过研究智舌检测致病性微生物的原理，摸索和优化检测条件，对获得的综合信息采用最佳的统计分析和模式识别，建立了一种水产品中致病性弧菌的快速检测新技术。结果表明，当试验菌株在麦氏弧菌特异性培养基中培养7h后，智舌能很好地区分11种致病性弧菌，区分效果佳的电极及其频率段组合为W(1、10Hz)、Ag(10、100Hz)、Au(100Hz)、Pd(100Hz) 电极。另外，智舌与SIMCA法相结合构建的上述6个电极及频率段组合下的判别模型能够很好地鉴别被试菌株是否为麦氏弧菌，其判别准确率均为100%。由此可见，该法为一种成本低廉、快速简便的麦氏弧菌快速筛检方法。本实验证明了智舌在实验室范围内可用于麦氏弧菌的快速检测，为智舌今后在食源性致病菌检测方面的广泛应用提供了良好的实验基础与理论依据。

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Rapid Detection of Vibrio metschnikovii by Smartongue

CHEN Chun-yan，DOU Wen-chao，TIAN Shi-yi，WANG Zhen-ying，LOU Fang-fang，ZHAO Guang-ying*
(College of Food Science and Biotechnology Engineering, Zhejiang Gongshang University, Hangzhou 310035, China)

The availability of Smartongue, a bionic sensor, for rapid detection of Vibrio metschnikovii was explored with the aim of proposing a rapid way to detect Vibrio metschnikovii in aquatic products. Smartongue combined with principal component analysis was used to discriminate among liquid cultures of 11 pathogenic Vibrio species to determine the availability of the combined techniques and minimum culture time. Meanwhile, optimal combinations of electrode and frequency were determined and then discrimination models for the detection of Vibrio metschnikovii was set up by combined use of Smartongue and soft independent modeling of class analogy (SIMCA) and validated. Optimal discrimination models were determined for high recognition rates to discover if combined Smartongue and SIMCA could be available for establishing a database for rapid detection of Vibrio metschnikovii. Eleven species of pathogenic Vibrio cultured in specific media for 7 h were successfully discriminated using Smartongue technique. The discrimination models based on 6 combinations of electrode and frequency showed a recognition rate of 100% for all samples. In conclusion, Smarttongue combined with SIMCA is available for rapid detection of Vibrio metschnikovii.

Smartongue; Vibrio metschnikovii; soft independent modeling of class analogy (SIMCA); rapid detection

TS207.4

A

1002-6630(2012)18-0165-06

2011-07-18

国家“863”计划项目(2007AA091806)；国家自然科学基金面上项目(30571623)；

2010年度浙江省大学生科技成果推广项目(新苗人才计划)(2010R408051)

陈春艳(1986—)，女，硕士，研究方向为食品质量与安全。E-mail：ccytina@163.com

*通信作者：赵广英(1960—)，女，教授，硕士，研究方向为食品质量安全快速检测、人畜共患病和食品卫生微生物学检测。E-mail：zhaogy-user@163.com