不同封包方法对局部ALA-PDT治疗老年Bowen病ALA透皮吸收和生物利用度的影响

佘文莉 陆 红 黄海玲 刘 晖 刘宏伟 谢光辉 谢 珊

(暨南大学附属第一医院整形激光美容科，广东 广州 510630)

Bowen病亦称原位鳞状细胞癌，为发生于皮肤或黏膜的表皮内鳞状细胞癌，最有效的治疗为手术切除，皮损较小时可采用电烧灼、冷冻或激光及液氮冷冻治疗。有研究将5-氨基酮戊酸(ALA)-光动力疗法(PDT)用于治疗老年 Bowen病〔1〕、慢性斑块型银屑病〔2〕、尖锐湿疣等皮肤疾病〔3〕，认为必须首先明确应用该法时影响透皮吸收和生物利用度的重要因素。本研究以迷你猪动物模型为基础，采用荧光检测法观察局部ALA-PDT疗法在不同封包条件(温度、溶剂、PH值、角质软化剂)下的透皮吸收和生物利用度(皮肤组织摄取ALA和转化PpIX能力)，分析找出局部ALA外用的最佳方法，并将其应用于临床治疗老年Bowen病，为ALA-PDT的推广应用提供指导性意见。

1 材料与方法

1.1 动物实验

1.1.1 建立迷你家猪动物模型 选取大小相近、体重10.0～15.0 kg、3～4月龄的迷你家猪，用相应剂量的戊巴比妥钠麻醉，随机分组，用龙胆紫溶液在每只动物背部皮肤标记实验区域。封包，在各模型组动物实验区域取组织3.0 g，制成细胞悬液，用荧光分光光度计检测标本中的荧光强度〔4，5〕。每组实验均设传统组，试剂为不含ALA的等量水溶剂。相对荧光强度(RFI)计算方法为:RFI=优化组平均荧光强度/传统组平均荧光强度。

1.1.2 不同封包温度ALA对透皮吸收和转化的影响 将20%的5-ALA水溶剂在避光条件下涂在标记处，用塑料薄膜避光封包。然后将动物恒温毯分别设置37℃、42℃，置于ALA涂抹处分别封包1、3、6、12 h，荧光光谱法检测组织中光敏剂原卟啉Ⅸ(PpⅨ)的含量。

1.1.3 不同溶剂ALA对透皮吸收和转化的影响 分别用生理盐水及2%月桂氮艹卓酮(Azone)制备20%的5-ALA溶液，在避光条件下涂在标记处，用塑料薄膜避光封包。分别封包1、3、6、12 h，荧光光谱法检测组织中光敏剂PpⅨ的含量。

1.1.4 有无使用角质软化剂ALA对透皮吸收和转化的影响10%水杨酸溶液预涂皮肤实验区域30 min，然后将20%的5-ALA水溶剂在避光条件下涂在标记处，用塑料薄膜避光封包。分别封包1、3、6、12 h，荧光光谱法检测组织中光敏剂 PpⅨ的含量。

1.1.5 不同pH值制剂ALA对透皮吸收和转化的影响 分别以枸橼酸盐缓冲液(pH4.0)、磷酸盐缓冲液(pH7.0)、硼酸-氯化钾缓冲液(pH9.0)，配制成pH值4.0、7.0、9.0的ALA制剂，在避光条件下涂在标记处，用塑料薄膜避光封包。分别封包1、3、6、12 h，荧光光谱法检测组织中光敏剂PpⅨ的含量。

1.2 临床实验 将上述实验得到的最佳封包方式应用于治疗老年Bowen病患者。选取我院收治的6例老年Bowen病患者，随机分配到两组，年龄范围58～75岁，平均(62±6.9)岁;其中男4名，女2名;病程6个月～5年，平均42.1个月;皮损分布于腿、背、手和前额等部位。优化组采用上述动物实验得到的最佳封包方法，传统组采用目前临床常用的治疗方法。将皮肤表面的鳞屑或痂皮利用医用胶带去除，治疗前将ALA(Sigma，美国)溶于特定pH的水性乳霜中，配成20%ALA霜剂，轻柔地涂布在皮损表面及其周围1 cm，以塑料薄膜封包，外面贴上适当大小的铝箔，嘱患者于黑暗环境中避光3～4 h(传统组)或特定时间(优化组)，依据肿瘤大小确定照射面积，选用630 nm的ALA-PDT治疗仪(博激世纪科技有限公司，武汉)照射，照射时间约30 min，照射剂量为50 J/cm2。上述光动力治疗每周2次，连续治疗4 w后行皮肤活组织切片检察，临床常规检查确定治疗效果和最佳封包方式。所有病例均随访6个月。

1.3 统计学分析 采用SPSS15.0软件对数据进行统计学处理，两组间样本均数比较采用独立样本t检验，多组样本比较采用方差分析。相关性研究采用Pearson相关系数检验(所有数据均以±s表示)。

2 结果

2.1 动物实验 对动物实验部分得到的不同封包条件下荧光光谱法检测组织中光敏剂含量的数据进行统计研究，见图1。温度对光敏剂的透皮吸收效率有显著影响(P＜0.05)，37℃条件下ALA透皮吸收和转化效率在12 h时达到最大吸收。用生理盐水或2%月桂氮艹卓酮制备20%的5-ALA，其荧光强度并无显著差异。有无使用角质软化剂对透皮吸收和转化效率，同样无显著影响。不同pH值制剂中，pH4.0的制剂吸收转化效率最高，随着制剂pH升高，其透皮吸收和转化效率显著降低(P＜0.05)。分析实验结果，封包3 h后ALA吸收速率减慢，6 h后已接近平台期，改变前三个变量时封包6 h与12 h疗效差异不大，但是在pH改变时却出现了显著差异(P＜0.05)，这使得封包条件由目前临床的3～4 h增加到12 h，虽然给患者造成了一些不便，却能显著提升ALA的吸收效率和生物利用度。

图1 不同封包条件下荧光光谱法检测组织中PpⅨ含量

2.2 体内实验 优化组采用生理盐水制备的20%的pH4.0的5-ALA制剂，在37℃下避光封包12 h的治疗方法。优化组3例患者经过上述治疗后，皮损消退，未留明显瘢痕。传统组中2例患者皮损消退，其中1例患者治疗效果不佳，仍具有明显瘢痕且复发，复发率为33.3%(1/3)。

3 讨论

十多项开放研究和随机对照研究已经证实，一次ALA-PDT用于治疗Bowen病的治愈率为86%(71/83)，2～3次治疗后升高到93%(239/257)，随访 3～36个月后复发率平均为12%〔6，7〕。本实验以迷你猪动物模型为基础，采用荧光检测法观察局部ALA-PDT疗法在不同封包条件(温度、溶剂、pH值、角质软化剂)下的透皮吸收和生物利用度(皮肤组织摄取ALA和转化PpⅨ的能力)的差异，找出局部ALA外用的最佳方法，并选取最佳方式用于临床治疗老年Bowen病，与传统治疗相比，虽然增加了封包时间，但是却使采用该法治疗Bowen病的效果更显著，复发率降低，为ALA-PDT的推广应用提供指导性意见。

1 颉玉胜，彭学标，范文成，等.5-氨基酮戊酸光动力疗法(ALA-PDT)治疗老年面部Bowen病的疗效观察〔J〕.中国美容医学，2011;20(6):959-60.

2 李康英，罗 东.ALA-PDT治疗银屑病机制与临床研究的新进展〔J〕.应用激光，2010;30(3):246-8.

3 侯淑萍，齐蔓莉，亓玉青，等.5-氨基酮戊酸-光动力疗法治疗尖锐湿疣和皮肤肿瘤的疗效观察〔J〕.天津医药，2009;37(9):791-2.

4 李晓松，顾 瑛，刘凡光，等.光动力学疗法治疗过程中鲜红斑痣病变组织内光敏剂含量检测的初步研究〔J〕.中国激光医学杂志，2007;16(2):82-7.

5 谢光辉，李康英，刘宏伟，等.ALA-PDT对正常人角质形成细胞生物效应的实验研究〔J〕.激光生物学报，2011;20(3):309-14.

6 Morton CA，Brown SB，Collins S，et al.Guidelines for topical photodynamic therapy:report of a workshop of the British Photodermatology Group〔J〕.Br J Dermatol，2002;146(4):552-67.

7 Sieroń A，Kwiatek S.Twenty years of experience with PDD and PDT in Poland〔J〕.Photodiag Photodynam Ther，2009;6(2):73-8.