携带PCV-2ORF2的感染性PRRSV克隆在Marc-145细胞表达的研究

郑海红，张可煜，周 艳，袁世山＊

（1.中国农业科学院上海兽医研究所动物传染病研究室，上海200232；2.中国农业科学院上海兽医研究所动物药学研究室，上海200232）

猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）是动脉炎病毒科（Arteriviridae）成员之一［1］。该病毒主要引起母猪流产、死胎、产弱仔、木乃伊胎等繁殖障碍以及仔猪与育肥猪的呼吸道疾病。猪体一旦感染了该病毒，往往为其他病毒侵入机体打开了通道，引发混合感染并进而造成更为严重的疾病甚至死亡［2-3］。猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）的流行给中国乃至世界养猪业都带来巨大经济损失。

为研制能防控PRRS的标识弱毒苗以及防控PRRS与其他病毒病的二联苗或多价苗，众多学者都试图把PRRSV作为稳定表达外源基因的载体。然而，多年来的研究表明，利用PRRSV作为载体表达外源基因，外源序列常常被逐步删除［4-5］，且这种删除现象在动脉炎病毒具有共性。有报道提出动脉炎病毒删除外源序列可能与外源序列的插入导致所插入位置及转录调控序列（transcription regulation sequence，TRS）的二级结构改变有关，同时还可能与外源序列的长度及其自身特性相关［6-10］。然而，更为详尽的机制却尚未阐明，因而无法在实践中指导构建能稳定表达外源序列的动脉炎重组病毒。

就PRRSV而言，若直接在基因组上插入外源序列而不对PRRSV基因组进行改造，外源序列常常缺失［4-5］；而若能对PRRSV基因组进行恰当的缺失／插入TRS等改造，则插入的外源序列则往往具有遗传稳定性［11-12］。据此，本研究借助前期构建的感染性克隆pCPV［5］为平台进行反向遗传操作，构建了含有部分Nsp2序列缺失的全长cDNA克隆，并进行了病毒的拯救和一系列遗传稳定性分析，为进一步探索和阐明PRRSV删除外源序列的机制，以及研制PRRSV标识性弱毒苗或PRRSV与其他病毒的二联苗或多价苗提供理论和物质基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞 MARC-145由中国农业科学院上海兽医研究所猪病实验室提供。细胞生长液为含100 mL／L胎牛血清（FBS，Gibco-BRL Cat＃16000）的DMEM（Gibco-BRL Cat＃12430），维持液为含20 mL／L FBS的DMEM。

1.1.2 引物 参照PRRSV基因组序列（GenBank accession number＃GQ330474），利用Primer 5.0软件设计引物，由上海英俊技术有限公司合成（表1）。

1.2 方法

1.2.1 重组全长cDNA的构建 全长感染性克隆pCPV由笔者构建并保存［5，13］，并将含全长Nsp2的片段从感染性克隆pAPRRS［14］上用KpnⅠ酶切下来，连接到已被KpnⅠ预处理的pBlueScript SK（＋）载体上，构建中间模板质粒pDnsp2。以pDnsp2为模板，采用Site-direct PCR方法进行Nsp2 108nt的缺失，将获得的PCR产物用DpnⅠ消化过夜后，直接转化。测序正确的中间阳性质粒命名为pDnsp2。将其与全长感染性克隆pCPV用KpnⅠ酶切，回收相应酶切产物后，用含有Nsp2缺失108nt的片段替代pCPV相应片段，构建全长突变体pDCPV，并用酶切及测序方法鉴定pDCPV（图1）。

图1 突变体pDCPV构建示意图Fig.1 Schematic representation of the procedures for construction of mutant pDCPV

1.2.2 DNA转染 用Qiagen公司的QIAprep Spin Miniprep kit（QIAgen Inc.）试剂盒提取突变体质粒pCPV和pDCPV，采用分光光度计测定各质粒浓度，确定转染体积，保证转染量为1μg DNA。将Marc-145细胞接种于6孔细胞培养板中，待细胞密度为80%左右时进行转染。将DNA按FuGENE®HD转染试剂（Roche）的转染方法转染Marc-145细胞，置37℃体积分数为5% 的CO2培养箱中培养观察。转染细胞后每天观察细胞，待细胞出现病变且病变达80%左右收取细胞上清（P0病毒上清）保存于-70℃。

1.2.3 病毒基因组RNA的提取及其鉴定 将收集的原代病毒细胞上清中的病毒基因组按Qiagen公司的QIAgen Viral RNA Mini Kit说明提取病毒RNA并悬于无核酸酶的水中。按宝生物工程（大连）有限公司的AMV和LA Taq说明书进行RTPCR，引物见表1，回收目的条带亚克隆后送上海英骏生物技术有限公司测序。

1.2.4 重组病毒的空斑纯化及其鉴定 依照病毒纯化方法［15］，将得到的P0病毒，纯化1次，并用RT-PCR鉴定出外源序列PCV-2ORF2不被删除的重组病毒［5］，并且将含有完整PCV-2ORF2序列的重组病毒继续纯化2次。将第3次纯化病毒的细胞上清液以0.01MOI，连续在Marc-145细胞上传代10次，收取每代病毒上清，保存于-70℃备用。提取第10代次的病毒RNA并悬于无核酸酶的水中，进行RT-PCR（参照1.2.3），鉴定重组病毒是否具有遗传稳定性。

1.2.5 空斑形态 将P0病毒悬液作连续递进1 000倍稀释，取200μL接种于已经长成单层的Marc-145细胞上37℃孵育1h后，做3个重复，其中一孔用来挑取空斑，进行纯化病毒，另两孔做空斑形态分析。将20g／L琼脂糖与2×DMEM以1∶1混合加到六孔板中，5mL／孔。室温凝固后，在37℃恒温箱倒置培养5d～6d。待出现空斑后，直接用50g／L结晶紫染色即可观察空斑形态。

表1 RT及PCR引物Table 1 Primers used for PCR and RT

2 结果

2.1 构建的全长cDNA克隆及拯救的重组病毒

经Site-direct PCR构建的中间阳性质粒pDnsp2经KpnⅠ单酶切后获得目的片段取代pCPV［5］中相应区域，经部分测序鉴定构建的重组全长cDNA克隆pDCPV（图2）构建成功。全长克隆pDCPV和pCPV［5］转染Marc-145细胞，转染至第5天左右出现细胞病变且待细胞病变达80%左右收取细胞上清，并视为P0病毒上清，将拯救病毒依次命名为vDCPV 和vCPV［5］。

图2 全长突变体pDCPV的构建Fig.2 Construction of the full-length mutant pDCPV

2.2 拯救的病毒vDCPV

拯救病毒P0vDCPV和vCPV细胞上清，RTPCR检测结果显示（图3），扩增vCPV的目的片段分子质量均小于预测分子质量（1 868bp），即所插入的外源序列PCV-2ORF2有删除，与以前结果一致［5］，而扩增vDCPV的目的片段分子质量大小不一，将目的片段克隆测序分析发现，分子质量偏小两条（标记为b，c带）目的片段中的PCV-2ORF2与vCPV一样有删除现象，而分子质量最大目的片段（标记为a带）中PCV-2ORF2保持完整。表明Nsp2的3 775nt～3 882nt缺失有利于重组病毒中的PCV-2ORF2稳定。

2.3 纯化病毒的遗传稳定性

图3 RT-PCR鉴定vCPV、vDCPV原代上清中的病毒基因组Fig.3 RT-PCR amplification of the genomic RNA of the P0vCPV，vDCPV

将得到的重组病毒P0vDCPV纯化1次，空斑形态见图4（3个重复孔的第1、2孔做空斑形态分析），可见2个重复孔中的空斑形态大小不同。挑取第3孔中的7个形态不一的空斑，在细胞上增殖病毒后，经RT-PCR扩增目的条带（图5A）后克隆测序得知，所挑取的形成7个空斑病毒中有一个空斑的病毒含有完整的PCV-2ORF2，即形成第6个空斑的病毒，并把这株重组病毒命名为vDCPVP，而形成其余空斑的病毒中PCV-2ORF2均有删除。将vDCPVP继续纯化2次，经RT-PCR鉴定，病毒基因组中PCV-2ORF2稳定存在（图5B）。将第3次纯化病毒的细胞上清液以0.01MOI，连续在Marc-145细胞上传代10次，提取第10代次的病毒RNA，进行RT-PCR（图5B），经核酸序列分析表明，外源序列PCV-2ORF2稳定地存在于至少10代子代病毒中。

图4 病毒的空班形态分析Fig.4 Analysis of the plague form of mutant virus

图5 RT-PCR鉴定纯化病毒vDCPVP中的PCV-2ORF2遗传稳定性Fig.5 RT-PCR amplification of the PCV-2ORF2 of purified virus vDCPVP

2.4 纯化病毒vDCPVP表达PCV-2cap蛋白

在vDCPVP感染Marc-145时，待出现微弱细胞病变，进行IFA，用PCV-2cap特异抗体检测cap蛋白的表达情况（图6），发现cap蛋白微量表达。

图6 IFA检测到cap蛋白微弱表达Fig.6 Cap protein can be expressed slightly for vDCPVP identified by IFA

3 讨论

前期研究表明，以北美PRRSV株为表达载体，不对Nsp2区域进行部分核苷酸缺失，在ORF1和ORF2间插入PCV-2的主要免疫原开放阅读框架（open reading frame，ORF）及两个酶切位点，获得的拯救病毒中的外源序列存在遗传不稳定性［5］。本研究结果显示，Nsp2区域缺失一段核苷酸（108nt）后不仅能拯救出病毒而且拯救的病毒经一系列空斑纯化，能纯化出含有完整PCV-2ORF2的重组病毒，这与以前Nsp2区域没有缺失获得的拯救病毒形成了鲜明对比，由此，直接证实了重组病毒存在遗传不稳定性是源于外源序列的插入导致全长基因组过长，由此影响了N蛋白与基因组作用及其他结构蛋白包装过程。

在动脉炎病毒科所有病毒中存在N蛋白分子量越大，则相应的基因组越大的规律［1］。由此推测，不对北美PRRSV株基因组进行缺失改造，仅插入PCV-2ORF2及2个酶切位点（712bp），过长外源序列插入使整个重组病毒基因组过长以致影响了N蛋白对重组病毒基因组的包装，进而影响其他结构蛋白的包装直至最终影响了整个病毒粒子的包装。在这种选择压力下，PRRSV通过删除外源序列的方式来获得最佳的生存条件，由此获得的重组病毒具有遗传不稳定性。因此，在本研究中尝试了对基因组的缺失改造，选择Nsp2区作为缺失对象源于，一是有研究证明Nsp2存在复制非必需区［10］，二是本研究采用的毒株APRRSV株比其他北美PRRSV经典毒株长108 nt。通过缺失Nsp2区多出的108nt，使得重组病毒全长基因组越接近于野生的北美PRRSV基因组，利于N蛋白对基因组的包装及其他蛋白的包装过程，获得的重组病毒也具有遗传稳定性。当然，不能否认重组病毒中仍有部分重组病毒存在遗传不稳定性，这可能是由于所缺失区域仍太短导致。

Calvert等和Pei等分别以北美PRRSV P129株的感染性克隆为操作平台，同样在ORF1和ORF2间分别插入绿色荧光蛋白（GFP）及两个酶切位点、PCV-2的主要免疫原开放阅读框架（ORF）及两个酶切位点。在此基础上，Calvert和Pei还在插入的外源序列和PRRSV ORF2之间额外引入了TRS6启动子序列。结果显示，都能获得具有遗传稳定性的重组病毒。鉴于以上结果，Calvert等认为只在PRRSV ORF1和ORF2间进行外源序列插入，而不加入额外启动子会影响PRRSV本身的ORF2正常转录［16-17］，所获得的重组病毒存在遗传不稳定性；而加入一个额外启动子，不仅可以让PRRSV本身的TRS2来启动外源序列的转录，而且额外引入的TRS6可以来启动PRRSV ORF2转录，从而不会影响PRRSV正常的转录，所获得的重组病毒就具有遗传稳定性。由此可见Calvert等阐释的PRRSV稳定表达外源基因的机制与本研究的结论不完全一致。究其缘由，一是Calvert等所用的病毒载体是P129株，相应的Nsp2比本研究所采用的APRRS株恰缺少本研究缺失掉的核苷酸，这可能是Calvert等能获得稳定病毒的主要原因，而不是影响到了转录导致的遗传不稳定性；笔者先前的研究中发现，在没有引入外源的TRS6时，PRRSV可以利用外源序列上的一段序列作为启动子来形成一些亚基因组，并且通过分析发现这些亚基因组发现其极大可能被病毒用以翻译PRRSV E或GP2b蛋白［5］，由此更进一步说明插入TRS6与否对PRRSV ORF2的正常转录没有影响。因此，PRRSV删除外源序列的最主要机制是源于外源序列的插入导致病毒基因组过长，由此影响到N蛋白与基因组作用及其他结构蛋白包装过程。

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