猪链球菌2型安徽分离株毒力基因cps2J、mrp、epf、sly的检测及其序列分析

许大文，魏建忠，孙 裴，殷宗俊，赵洪武，李 郁

（安徽农业大学动物科技学院，安徽合肥230036）

猪链球菌病是链球菌属中猪链球菌（Streptococcus suis）、马链球菌兽疫亚种、马链球菌类马亚种以及Lancefield分群中D、E、L群链球菌引致猪的传染病的总称，临床上主要表现为淋巴结脓肿、脑膜炎、关节炎、心内膜炎以及败血症等症状［1］。我国农业部将其列为二类动物疫病。猪链球菌是世界范围内引致猪链球菌病最主要的病原。根据荚膜多糖可将猪链球菌分为35个血清型，即1型～34型和1／2型。其中1型、2型、7型和9型对猪的致病性较强，猪链球菌2型（Streptococcus suis serotype 2，S.suis 2）在世界范围内流行最广，属于人兽共患传染病病原［2］。

S.suis 2的致病性与其携带的毒力因子密切相关，目前公认的主要毒力因子有荚膜多糖（capsular polysaccharide，CPS）、溶菌酶释放蛋白（muramidase-released protein，MRP）、胞外因子（extracellular protein factor，EPF）和溶血素（suilysin，SLY）等［3］。S.suis 2毒力基因表型的分布具有地域性的差异，某些地区以mrp或epf基因为主，而另一些地区则以sly基因为主［4］。本研究针对cps2J、mrp、epf和sly 4种毒力基因，对19株S.suis 2安徽分离株进行PCR检测及其扩增片段序列测定与比较，旨在了解S.suis 2安徽分离株毒力基因的分布特征，以及与国内外分离株之间的遗传关系，从而为S.suis 2安徽分离株的致病性研究奠定基础，为安徽省猪链球菌病的防控提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 受试菌株 19株S.suis 2安徽分离株均由安徽农业大学动物科技学院传染病研究室于2008年-2012年分离、鉴定及保存。菌株代号以分离地区和先后命名。

1.1.2 主要试剂 胰酪胨大豆酵母浸膏肉汤（TSB-YE）、胰酪胨大豆酵母浸膏琼脂（TSA-YE）均为绍兴天恒生物科技有限公司产品；胎牛血清为北京元亨金马生物技术开发有限公司产品；DNA Marker DL 2 000、r Taq DNA聚合酶、DNA胶回收试剂盒均为上海生工生物工程技术服务有限公司产品。

1.1.3 引物合成 参照文献［5-8］分别针对cps2J、mrp、epf、sly合成引物，引物均由上海生工生物工 程技术服务有限公司合成（表1）。

表1 本试验所用PCR引物Table 1 PCR primers used in this experiment

1.2 方法

1.2.1 基因组DNA制备与毒力基因的扩增 参照文献［9］提取细菌基因组DNA。PCR反应体系总体积为25μL：10×buffer MIX（MgCl2contained）2.5μL，dNTPs（2.5mmol／L）2μL，TaqDNA聚合酶（2.5U／μL）0.3μL，上游引物1μL，下游引物1μL，灭菌ddH2O 13.2μL，模板5μL。反应条件为：95℃5min；94℃1min，退火1min（cps2J、mrp、epf、sly检测的退火温度分别为56、55、60、58℃），72℃2min，循环40次；72℃10min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.2 PCR扩增产物的纯化与测序 PCR产物的回收与纯化按照DNA胶回收试剂盒的说明进行，将纯化的PCR产物送上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序。

1.2.3 基因序列分析 将cps2J、mrp、epf和sly基因测序结果与GenBank登录的国内外猪链球菌参考菌株的同源基因序列进行比对（表2），并用DNA Star软件进行基因变异分析。

表2 GenBank登录的国内外猪链球菌参考菌株Table 2 Domestic and international reference strains of Streptococcus suis accessioned in GenBank

2 结果

2.1 毒力基因鉴定

cps2J、mrp、epf和sly基因在19株S.suis2安徽分离株中的检出率分别为100%（19／19）、68.4%（13／19）、68.4%（13／19）、78.9%（15／19）。19个受试菌株共分为7个基因型：cps2J＋／mrp＋／epf＋／sly＋（11／19），cps2J＋／mrp＋／epf-／sly＋ （1／19），cps2J＋／mrp＋／epf-／sly-（1／19），cps2J＋／mrp-／epf＋／sly＋（1／19），cps2J＋／mrp-／epf＋／sly-（1／19），cps2J＋／mrp-／epf-／sly＋ （2／19），cps2J＋／mrp-／epf-／sly-（2／19）；其中cps2J＋／mrp＋／epf＋／sly＋为优势基因型（表3）。

表3 19株S.suis 2安徽分离株毒力基因检测结果Table 3 The test results of virulent genes of S.suis 2strains isolated from Anhui province

2.2 毒力基因序列分析

将19株S.suis2安徽分离株的cps2J及其中13个菌株的mrp基因、13个菌株的epf基因和15个菌株的sly基因部分序列与GenBank登录的同源基因进行同源性、基因变异分析。

2.2.1 同源性分析 19株S.suis2安徽分离株之间cps2J基因部分序列之间及其与国内、国外S.suis2参考菌株的同源性分别为99.7%～100%、99.4%～100%和98.3%～100%；13个S.suis2安徽分离株之间mrp基因部分序列之间及其与国内、国外S.suis2参考菌株的同源性的分别为99.1%～100%、99.1%～100%和99.2%～100%；13个S.suis2安徽分离株之间epf基因部分序列之间及其与国内、国外S.suis2参考菌株的同源性分别为100%、99.8%～100%和87.8%～100%；15个S.suis2安徽分离株之间sly基因部分序列之间及其与国内、国外S.suis2参考菌株的同源性分别为100%、100%和99.0%～100%。

2.2.2 基因变异分析S.suis2安徽分离株中仅菌株FD12在cps2J基因的比对序列中第548～549位存在GA插入突变，第550位由A突变为G（图1）。菌株HJ6和HJ3的mrp基因序列完全一致，在比对序列的第37～41位存在TGAAG 2个碱基插入突变，第47位A缺失，第64～65位有TA插入突变，第91位由G突变为C，第94～95位由GC突变为TT，第97位有T插入突变，第347位由G突变为T，第808位存在A插入突变，第814位由T突变为G；菌株FD12在比对序列的第1位由C突变为A，第349～356存在AATTGCTC的缺失突变；菌株HJ14在比对序列的第24位由G突变为C；菌株HJ15、HJ17在比对序列的第820位存在A插入突变（图2）。epf基因和sly基因的检测序列未检测出变异。

图1 cps2J基因部分序列的变异位点Fig.1 Variation site of cps2Jgene nucleotide sequence

图2 mrp基因部分序列的变异位点Fig.2 Variation site of mrpgene nucleotide sequence

3 讨 论

根据毒力不同，S.suis2分为强毒株、弱毒株和无毒株，其致病机理目前还不很清楚，但普遍认为其致病性与其毒力因子有关［10］。S.suis2的4种毒力因子（CPS、MRP、EPF和SLY）在不同毒力菌株中的分布有较大差异，临床分离株常存在一种乃至全部毒力基因的缺失现象，而典型的强毒株常带有这4种 毒 力 基 因［8，11-12］。1999 年，Staats J J 等［13］报道，5株S.suis2强毒株的毒力基因型均为cps2J／mrp＋／ef＋／sly＋。Wei Z等［14］报道，我国16个省份在2003年-2007年分离176株S.suis2，有54%的毒力基因型为cps2J＋／mrp＋／epf＋／sly＋。张九州等［12］报道，2007年-2008年从河南省分离的8株S.suis2，有4株毒力基因型为cps2J＋／mrp＋／epf＋／sly＋。王花茹等［15］检测四川资阳猪2型链球菌病的12株临床分离株的毒力基因，结果均为cps2J／mrp＋／ef＋／sly＋。赵战勤等［16］将毒力基因型为cps2J／mrp＋／ef＋／sly＋的16株S.suis2进行小鼠致病性试验，结果均能致死全部小鼠。本试验针对这4种毒力基因进行了19株S.suis2安徽分离株的检测，结果显示，57.9%（11／19）菌株的毒力基因型为cps2J＋／mrp＋／epf＋／sly＋，为优势基因型，表明安徽省猪群中流行的S.suis2毒力基因的分布特征与国内外报道的相似，CPS、MRP、EPF和SLY是安徽省流行的S.suis2的重要毒力因子。

序列同源性分析显示，S.suis2安徽分离株4种毒力基因的检测序列之间及其与国内其他地区S.suis2分离株的相应序列同源性很高（均在99.1%以上），与国外S.suis2分离株的相应序列同源性相对较低（87.8%～100%）。基因序列变异分析表明S.suis2安徽分离株的mrp基因存在相对较大的变异，13株mrp＋菌株中有6株发生了序列变异，其中HJ3和HJ6序列的变异最大。参考菌株中仅浙江GQ352520在比对序列的第657位存在由T突变为C的点突变，其他序列完全一致。表明S.suis 2安徽分离株的mrp基因具有不同程度的分化，与国内外其他地区S.suis 2分离株序列存在较大差异。S.suis 2的MRP存在多种突变体，MRP＊表示分子质量大于136ku的MRP突变体，MRPS用来表示分子质量小于136ku的MRP突变体［8］。S.suis 2安徽分离株中可能存在 MRP＊或MRPS，但由于检测序列不是基因全序列，这些碱基突变是否是有义突变，是否存在移码突变，及其对S.suis 2的致病性的影响还有待进一步研究。

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