抗非洲猪瘟病毒VP73蛋白单克隆抗体的制备

陈 轶，吴晓东，邹艳丽，赵金山，包静月，曹金山，王志亮＊

（1.中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛266114；2.内蒙古农业大学兽医学院，内蒙古呼和浩特010018）

非洲猪瘟（African swine fever，ASF）是一种由非洲猪瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）感染引起的猪的急性、烈性、高度接触性传染病［1］。ASFV是非洲猪瘟病毒科（Asfarviridae）非洲猪瘟病毒属（Asfivirus）惟一成员［2］，为具有囊膜的双股DNA病毒，蜱类是其主要自然宿主和传播媒介［3-4］。ASFV感染猪后以高热、食欲废绝、皮肤和内脏器官出血为临床特征，病死率极高［5］。因此，ASF是世界动物卫生组织（OIE）要求法定报告的动物疫病，也是《中华人民共和国动物防疫法》规定的一类动物疫病［6］。

ASFV整个基因组含有160个～175个开放阅读框（ORF），编码150种～200种蛋白质［7］。根据Pubmed中所列西班牙BA71V分离株全基因序列显示，ASFV基因组含有151个主要阅读框，编码数量众多的蛋白［7］。VP73蛋白是ASFV的主要结构蛋白，由B646L基因编码，全蛋白分子质量约为73 ku［8］。VP73蛋白是病毒粒子20面体衣壳的重要组成部分，产生于病毒感染的晚期，约占整个病毒粒子蛋白的32%［9］。VP73蛋白在ASFV结合和进入易感细胞过程中有很重要的作用［10］，并对病毒粒子衣壳的产生起至关重要的作用［11］。ASFV大多数分离株的毒力都很强，但是免疫原性很低，只有少数几个蛋白具有免疫原性。有研究表明，不同区域ASFV分离株诱导产生的抗VP73蛋白抗体的相应抗原表位都相当保守［12］。VP73蛋白的免疫原性很稳定［13］，可以被用来作为血清学检测和免疫制剂。李倩等［14］对非洲猪瘟病毒VP73蛋白的B细胞表位进行了预测。本研究在对ASFV VP73蛋白主要抗原表位区原核表达的基础上，制备了相应的单克隆抗体。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种、质粒、动物和细胞 宿主菌E.coli BL21（DE3）为Invitrogen公司产品；重组质粒pET32a-vp73、非洲猪瘟病毒阳性血清、Balb／c小鼠及小鼠骨髓瘤细胞株（SP2／0）均由中国动物卫生与流行病学中心保存。

1.1.2 试剂 非预染蛋白Marker和预染蛋白Marker为Fermentas公司产品；His Bind Purification Kit为Novagen公司产品；BCA蛋白定量试剂盒为Biomiga公司产品；弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、PEG和辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗鼠和羊抗猪IgG均为Sigma公司产品；HT、HAT和DMEM均为Invitrogen公司产品；胎牛血清为Thermo Fisher Scientific公司产品。其他试剂均为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 免疫原的制备

1.2.1.1 重组质粒的鉴定和表达 用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切重组质粒pET32a-vp73，将酶切产物进行30g／L琼脂糖凝胶电泳。将重组质粒pET32a-vp73委托宝生物工程（大连）有限公司测序。将空质粒pET32a（＋）和重组质粒pET32avp73分别转化至E.coli BL21（DE3）感受态细胞中。将重组菌接种至含氨苄青霉素抗性的LB液体培养基中，37℃振摇至OD 600nm值约为0.6，加入终浓度为0.8mmol／L的IPTG，诱导4.5h，菌体裂解后，120mL／L SDS-PAGE电泳鉴定蛋白表达情况。

1.2.1.2 目的蛋白的纯化及鉴定 按His Bind Purification Kit操作说明纯化重组vp73蛋白，BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。以非洲猪瘟阳性血清为一抗，HRP标记的羊抗猪IgG为二抗，Western blot鉴定目的蛋白。

1.2.2 MAb的制备

1.2.2.1 动物免疫 初免用弗氏完全佐剂乳化纯化的重组vp73蛋白，皮下注射免疫8周龄的Balb／c小鼠（100μg／只）；二免三免用弗氏不完全佐剂乳化纯化后的重组vp73蛋白，皮下注射免疫（100 μg／只）；每次免疫间隔14d。于融合前3d以50 μg／只的剂量腹腔注射加强免疫一次。

1.2.2.2 杂交瘤细胞株的建立 加强免疫Balb／c小鼠3d后，按常规方法无菌取小鼠脾细胞与SP2／0骨髓瘤细胞在PEG的作用下融合，融合细胞在含200mL／L胎牛血清的HAT培养基中进行选择性培养，5d后半换液，10d后改用HT培养基培养。待细胞长至培养孔1／5以上时，吸取培养上清以间接ELISA方法筛选阳性孔，采用有限稀释法对阳性杂交瘤细胞进行连续3次克隆化，直至克隆孔阳性率达到100%，扩大培养，冻存。

1.2.2.3 腹水诱生 将阳性杂交瘤细胞以5×105个／只～10×105个／只的剂量腹腔注射经液体石蜡致敏后的Balb／c小鼠，7d～10d后收集腹水，可取多次，10 000r／min离心10min取上清，分装标记并冻存。

1.2.3 MAb特异性鉴定

1.2.3.1 酶联免疫吸附（ELISA）检测 将纯化后的重组vp73蛋白和含pET-32a（＋）空质粒的菌体蛋白，用包被液稀释至2μg／mL，分别包被ELISA板，以制备的单克隆抗体腹水和培养液上清为一抗，HRP标记的羊抗鼠IgG为二抗，进行间接ELISA。

1.2.3.2 Western blot检测 将纯化后的重组vp73蛋白和含pET-32a（＋）空质粒的菌体蛋白进行120mL／L SDS-PAGE电泳，转印PVDF膜，以制备的单克隆抗体腹水和培养液上清为一抗，HRP标记的羊抗鼠IgG为二抗，DAB显色。

1.2.3.3 MAb亚类及效价测定 按说明书操作应用MAb亚类鉴定试剂盒对MAb的亚类进行鉴定。单抗腹水作倍比稀释，采用间接ELISA测定单抗腹水的效价。

2 结果

2.1 重组质粒酶切鉴定与测序结果

酶切结果显示，重组质粒经BamHⅠ和XhoⅠ双酶切，获得大小约为612bp的目的DNA片段及5 900bp左右的pET-32a（＋）载体片段，初步表明重组质粒中含有预期大小的目的DNA片段（图1）。测序结果表明，载体插入目的DNA片段长度为612 bp，与GenBank中的非洲猪瘟病毒VP73基因序列（登陆号S89966，627bp～1 238bp）比对结果一致，证明目的DNA片段插入正确。

图1 重组质粒pET32a-vp73酶切分析Fig.1 Identification of recombinant plasmid pET32a-vp73with enzyme digestion

2.2 目的蛋白SDS-PAGE电泳、纯化、浓度测定及Western blot检测

120mL／L SDS-PAGE电泳结果分析表明重组菌在终浓度为0.8mmol／L的IPTG诱导表达4.5 h后可产生大小约为43ku的融合蛋白条带，与预期结果基本一致，且目的蛋白纯化效果较好（图2）。纯化后目的蛋白浓度为2.5mg／mL。Western blot检测表明该融合蛋白具有良好的反应原性（图3）。

2.3 细胞株的筛选及克隆化

经筛选，得到3株（1C8、2D5、5F6）针对 ASFV VP73蛋白主要抗原表位区的MAb杂交瘤细胞株，经三次亚克隆后阳性率达到100%，杂交瘤冻存复苏后，其中两株（2D5、5F6）丧失分泌抗体的能力，最终得到一株稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株（1C8）。

图2 pET32a-vp73表达产物及纯化产物SDS-PAGE分析Fig.2 SDS-PAGE of pET32a-vp73expression products and purified products

图3 VP73蛋白的免疫印迹分析Fig.3 Western blot analysis of VP73protein

2.4 MAb的鉴定

2.4.1 ELISA检测结果 结果显示，杂交瘤（1C8）培养上清和腹水与重组蛋白VP73具有较强的反应性，而不与含pET-32a（＋）空质粒表达的菌体蛋白反应（表1）。

表1 单抗（1C8）特异性分析Table 1 Specificities of MAb tested by indirect ELISA

2.4.2 Western blot检测结果 蛋白检测结果显示，该株MAb可特异性识别非洲猪瘟病毒重组VP73蛋白，而不与含pET-32a（＋）空质粒表达的菌体蛋白反应（图4）。

图4 腹水单抗的Western blot检测Fig.4 Western blot analysis of the monoclonal antibody in ascites

2.4.3 腹水效价及抗体亚类鉴定结果 1C8的腹水抗体效价达到1.024×105。抗体亚类鉴定结果表明，该MAb抗体类型为IgG1亚类。

3 讨论

ASFV基因组是大分子线状双链DNA，通过双向凝胶电泳证实ASFV粒子大约含有50种蛋白质，这些蛋白是构成ASFV粒子结构的主要成分。VP73蛋白是ASFV主要结构蛋白之一，在病毒粒子中含量最大，且被证明具有较强的抗原性。VP73参与了病毒的吸附过程，针对VP73的抗体可以阻断病毒与巨噬细胞的结合。

本研究原核表达了VP73蛋白基因主要抗原表位区，通过免疫印迹分析法验证了该融合蛋白具有良好的反应原性，在此基础上以该蛋白作为抗原免疫小鼠，最终获得了一株稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株1C8。ELISA和Western blot检测结果表明，所制备的MAb具有较强的特异性，有较高的抗体效价。

国外有研究表明，虽然ASFV基因中负责免疫逃避机制的基因序列已经确定［15-16］，疫苗的研制也出现了一定的转机，但是短期内成功制备有效的疫苗仍有一定困难［12］。而最近五年来，ASF一直在欧亚大陆接壤的高加索地区三国以及俄罗斯联邦的部分地区肆虐，给当地的养猪业造成了巨大的损失［12］；我国北方的生态环境和动物分布与ASF流行地区相似，ASF对我国威胁很大。抗非洲猪瘟病毒VP73蛋白MAb的成功制备，为随后建立快速准确的ASFV血清学检测方法奠定了基础。

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