江苏省实验兔球虫感染情况调查研究

宋鸿雁，朱顺星，刘 春，邵义祥

（南通大学实验动物中心 江苏省开放性动物实验中心，江苏南通226001）

家兔是生物医学研究中常用的实验动物，在免疫学研究、药物研究、人类疾病模型等多个研究领域发挥重要作用。近年来，我国十分重视实验动物科学的发展，逐步建立和完善了实验动物质量监测体系，包括实验兔在内的实验动物质量有了很大提高。然而，兔病仍是影响实验兔健康的巨大威胁。兔球虫病是家兔最常见的危害最严重的疾病之一，是一类由艾美耳属（Eimeria）的球虫寄生于家兔肝胆管及肠上皮细胞内而引起的寄生性原虫病，流行非常普遍，世界各地均有发生。家兔球虫病在临床上以腹泻、生长缓慢、消瘦为主要特征，引起较高的发病率和死亡率，幼兔感染率高达90%以上，病死率高达40%～70%［1］。

多年来，国内外学者对兔球虫病进行了相关研究［2-5］，但目前，对兔球虫病研究的广度和深度均远远落后于禽球虫病。仅有的一些流行病学资料也主要集中于对生产型兔场或散养兔的报道，报道显示目前国内兔球虫感染非常普遍［6-10］。相对于商业用兔，实验兔球虫感染情况的调查资料更加匮乏，周智君等［11］对湖南省部分地区实验兔寄生虫病的情况进行了调查，结果显示实验兔球虫检出率为100%，这一结果令人不安。实验动物质量直接影响科学研究实验结论及生物制品的质量，越来越受到关注和重视，在现行的国家标准中球虫被列为实验兔应排除（除普通级外）的寄生虫之一［12］。江苏省聚集了多所高等院校、科研单位及制药企业，近年来实验兔用量大幅度增加，据了解，仅江苏省苏北地区某养殖公司年出栏科研、生物制药用实验兔达200余万只。但是，关于江苏省实验兔球虫感染情况的调查研究尚未见报道，本研究开展了江苏省苏北、苏中、苏南和南京地区主要实验兔供应基地的实验兔球虫感染情况的调查，为确保高质量的实验动物，保证科学实验顺利开展，对实验兔的球虫感染情况进行系统、全面的调查研究具有十分重要的意义。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂 饱和食盐水溶液，25g／L重铬酸钾。1.1.2 主要仪器设备 光学显微镜（OLYMPUS CX41），麦氏计数板，40目、60目、80目和100目铜筛，电子天平，离心机，恒温培养箱。

1.2 方法

1.2.1 样品采集 以江苏省苏北、苏中、苏南及南京地区的4个实验兔养殖供应基地为调查对象，按照4个不同的地点编号为1、2、3、4，每个采样点随机采集15份新鲜粪样，每个粪样20g左右，将粪样放入预先编号的采样袋内，立即带回实验室，放入4℃冰箱中保存。

1.2.2 样品卵囊检查 用饱和盐水漂浮法和Mc-Master′s法，逐份检查感染情况和感染强度，并计算出感染率和克粪便卵囊数（OPG）。

1.2.3 卵囊的收集与培养 采用饱和盐水漂浮法收集球虫卵囊，将粪样加清水浸泡、捣碎，分别用40、60、80、100目铜筛过滤，将滤液以转速3 000 r／min，离心10min，取沉淀加饱和盐水混匀，静置30min，以转速3 000r／min，离心10min，取上清加5倍体积的水，再离心洗涤1次，收集沉淀，即为球虫卵囊。将离心收集的球虫卵囊加入25g／L的重铬酸钾，混匀，移至平皿中28℃恒温培养，每天吹打1次～2次，直到85%的卵囊孢子化为止，收集培养的球虫卵囊，4℃保存备用。

1.2.4 虫种鉴定 显微镜下随机观察每个粪样50个卵囊，对卵囊进行拍照，用Sharp Capture软件测定卵囊大小、计算形状指数，并观察卵囊形态特征、颜色、卵膜孔的有无、内外残体的有无等，根据卵囊特征，参照文献［1，13］进行虫种鉴别，计算出每种卵囊所占的百分比。

2 结果

2.1 江苏地区实验兔球虫感染率和感染强度

本试验共调查了江苏地区4个实验兔养殖供应基地的兔粪样60份，粪样检查发现，4个基地实验兔感染率为100%。苏北地区的实验兔球虫OPG值最高，南京地区最低（表1）。

表1 江苏地区实验兔球虫感染率和感染强度Table 1 The infection rate and intensity of coccidia in experimental rabbits in Jiangsu province

2.2 各球虫种类及检出率

从调查、鉴定结果来看，此次江苏地区实验兔共检出10种兔艾美耳属球虫，分别是斯氏艾美耳球虫、穿孔艾美耳球虫、中型艾美耳球虫、大型艾美耳球虫、梨型艾美耳球虫、无残艾美耳球虫、盲肠艾美耳球虫、肠艾美耳球虫、小型艾美耳球虫、黄艾美耳球虫，且全部为混合感染（图1）。最常见的球虫是穿孔艾美耳球虫，所占比例为27.97%，其次为无残艾美耳球虫，比例为15.08%，再次为肠艾美耳球虫，比例为11.47%。其中苏北地区优势种为无残艾美耳球虫（33.71%），苏中地区优势种为肠艾美耳球虫（23.88%），苏南地区和南京地区和优势种均为穿孔艾美耳球虫（48.77%、37.23%）（表2）。

图1 江苏省10种艾美耳球虫孢子化卵囊形态（400×）Fig.1 Representative sporulated oocysts of 10species of Eimeriafrom experimental rabbits in Jiangsu province（400×）

表2 江苏省实验兔各种球虫感染百分比Table 2 The percentage of each coccidian species in experimental rabbits in Jiangsu province

3 讨论

本试验共调查了江苏省苏北、苏中、苏南及南京地区4个实验兔基地的兔球虫感染情况，结果发现，均有球虫感染，感染率为100%，且均为多种球虫的混合感染，此结果与文献［3，14］报道的甘肃、安徽地区养殖的商业兔球虫感染情况一致。据资料报道在不同地方的种类不完全一致，本次调查共查出10种艾美耳球虫，分别是斯氏艾美耳球虫、穿孔艾美耳球虫、中型艾美耳球虫、大型艾美耳球虫、梨型艾美耳球虫、无残艾美耳球虫、盲肠艾美耳球虫、肠艾美耳球虫、小型艾美耳球虫、黄艾美耳球虫，其中最常见的球虫是穿孔艾美耳球虫，所占比例为27.97%，其次为无残艾美耳球虫，比例为15.08%，再次为肠艾美耳球虫，比例为11.47%。本次调查出的10中兔艾美耳球虫种类与文献［10］对国内14个省兔场球虫感染调查结果一致，Jing F等［10］报道国内流行率最高的球虫种类为穿孔艾美耳球虫，其次为中型艾美耳球虫，再次为大型艾美耳球虫、无残艾美耳球虫、肠艾美耳球虫。而马永华等［3］报道甘肃兰州地区发现了12种兔球虫，除以上10种艾美耳球虫，还报道了松林艾美耳球虫和新兔艾美耳球虫，程宝艳还报道了报道安徽肥西地区发现那格浦耳艾美耳球虫［14］。

本次调查中，虫种鉴定是从形态学方面进行的，为了保证球虫类型鉴定结果真实可靠，应当结合分子生物学手段，与形态学鉴定相结合，这样获得的数据才更加可靠。Cere N等［15］根据球虫的基因特性鉴别球虫，Oliveira U C等［16］运用PCR方法鉴别了11种兔艾美耳球虫，这些方法的运用有利于从分子水平鉴定虫种。

现行的国家标准《实验动物寄生虫学等级及监测》，规定艾美耳球虫为清洁级兔必要时检测项目，要求为阴性，而SPF级兔必须检测艾美耳球虫，要求为阴性。随着实验兔的用量越来越多，应用范围越来越广泛，国家对实验兔质量控制要求也会越来越高。此次调查的江苏地区实验兔球虫的感染率高达100%，且全部为混合感染，究其原因可能有以下几个方面：首先，饲养管理不科学，卫生消毒制度不规范，造成病原能够长时间存活在舍内，因而兔群长期持续感染；其次，不能选用正确的药物进行治疗和预防，这样不利于对球虫病的控制，药物滥用或误用还会增强球虫的耐药性，从而难以彻底地消除该病。兔球虫感染通常呈亚临床症状，兔外观正常，但可能导致饲料转化率下降，生长受阻，影响各项生理指标，作为教学与科研用的试验兔更是可能会影响试验数据。鉴于此次调查结果发现，实验兔普遍感染艾美耳球虫，因此，为确保提供高质量的实验兔，保证科学实验顺利开展，采取科学的防治措施防控兔球虫病的发生具有十分重要的意义。

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