新城疫病毒抗体ELISA 检测方法的建立与应用

索南元旦

（青海省玉树州畜牧兽医工作站，青海玉树815000）

新城疫（Newcastle disease，ND）是由副黏病毒科（Paramyxoviridae）副黏病毒亚科（Paramyxovirinae）禽腮腺炎病毒属（Avulavirus）的新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）引起的禽类高度接触性、烈性传染病，被世界动物卫生组织（OIE）列为必须报告的动物传染病，呈世界性分布，每年全球因鸡新城疫所造成的直接经济损失达数十亿元，是危害全球养鸡业的最重要传染病之一［1-5］。该病也是影响我国养禽业健康发展的重要疫病之一，对我国禽类产品的食品安全以及人类健康都存在着潜在危害［6-7］。NDV常规的病毒分离技术和分子生物学检测方法存在周期长、操作复杂等缺点，无法满足基层兽医部门大批量样品检测的需要。NDV基因组全长15186bp，编码6种结构蛋白，其中血凝素-神经氨酸酶糖蛋白（HN）为病毒囊膜蛋白，是病毒复制必需蛋白，为病毒特异性保护性抗原，存在中和B细胞抗原表位，能够诱导机体产生特异性免疫应答，是NDV诊断试剂研究的常用蛋白［8-11］。本研究以重组HN蛋白为包被抗原，建立了一种简单、快速、特异、敏感新城疫病毒抗体检测方法，为基层兽医部门新城疫病毒抗体的检测、监测及流行病学调查等提供一种有效的检测技术。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 抗原与血清 原核表达的新城疫病毒重组HN蛋白由青海省动物疾病中心实验室制备并保存。H9亚型禽流感病毒（H9AIV）、传染性支气管炎病毒（IBV）、鸡传染性法氏囊病病毒（IBDV）、减蛋综合征病毒（EDSV）阳性血清及NDV参考阴性、阳性血清均购自中国兽医药品监察所。检测用血清样品由青海省动物疾病中心实验室收集并保存。

1.1.2 主要试剂 辣根过氧化物酶（HRP）标记的兔抗鸡IgG为Sigma公司产品；TMB底物液购自天根生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 包被抗原 纯化的新城疫病毒重组HN蛋白经SDS-PAGE分析验证后，采用Bradford法测定蛋白浓度，置于-70℃保存。

1.2.2 NDV HN间接ELISA操作程序 将纯化后的重组HN抗原用碳酸盐缓冲液（CBS）适当稀释后，每孔100μL包被ELISA反应板，置4℃过夜。次日洗涤后，加入适当封闭液，置37℃封闭适当时间。洗涤后，加入适当稀释后的血清样品（一抗），置37℃作用适当时间。洗涤后，加入适当稀释的辣根过氧化物酶（HRP）标记的兔抗鸡IgG（酶标二抗），置37℃作用适当时间。洗涤后，每孔加入100μL TMB底物显色液，置37℃作用适当时间。加入2mol／L H2SO4终止反应。用酶标仪在波长450 nm处测定每孔的吸收值（OD450nm值）。

1.2.3 NDV HN间接ELISA反应条件的优化

1.2.3.1 抗原最佳包被浓度和血清最佳稀释度的确定 采用方阵滴定法，将不同浓度（51.2、25.6、12.8、6.4、3.2、1.6、0.8、0.4μg／mL）重组的 HN蛋白与不同稀释度（1∶50、1∶100、1∶200、1∶400）的一抗组成方阵，保持其他反应条件不变，确定最适合的抗原最佳包被浓度和一抗最佳稀释度。

1.2.3.2 酶标抗体最佳稀释度与最佳作用时间的确定 采用方阵滴定法，将不同稀释度（1∶2 000、1∶4 000、1∶6 000、1∶8 000）的 HRP标记的兔抗鸡IgG 与酶标抗体不同作用时间（30、60、90、120 min）组成方阵，保持其他反应条件不变，确定最佳的酶标抗体稀释度和作用时间。

1.2.3.3 最佳封闭液与最佳封闭时间的确定 采用方阵滴定法，将不同封闭液（50g／L脱脂奶粉、10 mL／L BSA、100mL／L小牛血清、PBST）与不同封闭时间（30、60、90、120min）组成方阵，保持其他反应条件不变，确定最佳封闭液与封闭时间。

1.2.3.4 一抗最佳作用时间的确定 一抗分别作用30、60、90、120min，保持其他反应条件不变，确定最佳的一抗作用时间。

1.2.3.5 TMB底物最佳作用时间的确定 TMB底物分别作用5、10、15、20min，保持其他反应条件不变，确定最佳的底物作用时间。

1.2.4 NDV HN间接ELISA判断标准的确定

利用NDV HN间接ELISA已确定的最佳反应条件检测48份NDV阴性血清样品，计算48份样品的OD450nm平均值（¯X）和标准差（SD），将¯X＋3SD设为临界值。即样本OD450nm≥¯X＋3SD判为阳性，样本OD450nm＜¯X＋2SD判为阴性，当¯X＋2SD≤样本OD450nm＜¯X＋3SD判为可疑。

1.2.5 交叉反应试验 用已建立的NDV HN间接ELISA检测 AIV（H9亚型）、IBV、IBDV、EDSV 阳性血清，同时设NDV阳性血清和阴性血清对照，确定检测方法的特异性。

1.2.6 灵敏度检测 将NDV阳性血清按1∶50、1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1 600、1∶3 200、1∶6 400、1∶1 2800、1∶25 600稀释，用已建立的NDV HN间接ELISA检测，确定检测方法的敏感性。

1.2.7 重复性试验

1.2.7.1 批内重复性试验 选取NDV阳性血清样品和阴性血清样品各3份，在相同时间用同一块ELISA反应板检测，每份血清样品做6个重复，统计变异系数。

1.2.7.2 批间重复性试验 选取NDV阳性血清样品和阴性血清样品各3份，在4个不同时间分别用4块ELISA反应板检测，统计变异系数。

1.2.8 临床应用 应用已建立的NDV HN间接ELISA和血凝抑制试验（HI）同时检测采集于各地的568份血清样品，统计血清抗体阳性率，同时统计NDV HN间接ELISA方法相对于HI的特异性、敏感性及符合率。

2 结果

2.1 诊断抗原的制备

纯化的重组HN蛋白（图1）经Bradford法测定浓度为0.512mg／mL。

图1 HN纯化蛋白的SDS-PAGE分析Fig.1 SDS-PAGE analysis of purified HN protein

2.2 NDV HN间接ELISA最佳反应条件的确定

经优化，重组抗原最佳工作浓度为3.2μg／mL，血清最佳稀释度为1∶100；酶标抗体最佳稀释度为1∶4 000，最佳作用时间为60min；最佳封闭液为10 mL／L BSA，最佳封闭时间为60min；一抗最佳作用时间为60min；TMB底物最佳作用时间为15min。

2.3 NDV HN间接ELISA判定标准的确定

NDV HN间接ELISA检测48份NDV阴性血清样本的OD450nm平均值和标准差分别为0.202与0.061。计算出NDV HN间接ELISA的判断标准为：样本OD450nm≥0.385为阳性；样本OD450 nm＜0.324为阴性；0.324≤样本OD450nm＜0.385为可疑，对可疑样本须重新检测。

2.4 交叉反应试验结果

如表1所示，NDV HN间接ELISA检测AIV（H9亚型）、IBV、IBDV、EDSV 阳性血清的 OD450 nm值均低于0.324，不发生交叉反应，表明建立的检测方法具有较好的特异性。

2.5 灵敏度检测试验结果

如图2所示，NDV HN间接ELISA检测NDV阳性血清的最低稀释度为1∶12 800（OD450nm=0.401），表明建立的检测方法具有较好的敏感性。

2.6 重复性试验结果

批内重复性试验的变异系数集中在3.24%～4.55%之间（表2）；批间重复性试验的变异系数集中在4.12%～8.22%之间（表3）。表明建立的检测方法具有较好的重复性。

表1 交叉反应试验结果Table 1 Result of cross-reaction

图2 NDV HN间接ELISA灵敏度检测Fig.2 Sensitivity test of NDV HN indirect ELISA

2.7 临床应用检测结果

568份血清样品，用NDV HN间接ELISA检测出阳性样品466份，阳性率为82.0%；HI检测出阳性样品458份，阳性率为80.6%。HI检测为阳性的458份血清样品，用NDV HN间接ELISA检测，阳性451份，阴性7份，NDV HN间接ELISA相对于HI的敏感性为98.5%（451／458）；HI检测阴性的110份血清样品，NDV HN间接ELISA检测出阴性95份，阳性15份，NDV HN间接ELISA相对于HI的特异性为86.4%（95／110）；HN间接ELISA相对于 HI的总符合率为96.1%（546／568）。

表2 批内重复性试验结果Table 2 Intro-batch repetition test

表3 批间重复性试验结果Table 3 Inter-batch repetition test

3 讨论

目前，对于新城疫病毒的诊断主要以病毒的分离鉴定和分子生物学方法等病原学检测手段为主，病原学检测方法虽然准确，但试验周期长、操作复杂、不适合大批量样品检测。血清学等抗体检测方法虽然目前不能有效区分自然感染抗体和疫苗免疫抗体，但由于血清样品采集方便、容易保存和高通量检测等优点而被广泛应用，且在知道流行病学的前提下，证实其抗体阳性就已经具有了诊断意义。目前新城疫的抗体检测主要以血凝抑制试验（HI）为主，HI虽然操作简单、但存在敏感性较低，血清的质量对检测结果影响较大，肉眼判读、误差大等缺点，不适合基层兽医工作者广泛使用。随着酶免疫技术的发展，ELISA逐步应用于新城疫病毒的抗体检测，Snyder D B等［12］利用纯化的新城疫全病毒作为包被抗原，建立了检测新城疫抗体的间接ELISA方法。Thayer S G等［13］通过比较间接 ELISA、HI、AGP三种新城疫病毒抗体检测方法，得出间接ELISA方法具有微量、敏感、特异、高通量的优点，将在新城疫抗体的检测上具有广阔的应用前景。张国中等［14］分别采用间接ELISA和HI两种方法对临床上收集的152份HI滴度不同的血清样品和ND的标准阴、阳性血清进行了新城疫病毒抗体检测，并分析了间接ELISA和HI两种方法的相关性，得出间接ELISA快速、高通量、敏感、特异，较HI更适合于新城疫抗体的检测和流行病学调查。但以往的间接ELISA多以全病毒作为包被抗原，全病毒由于受病毒培养与纯化方面的限制，存在特异性低、成本高、容易散毒等缺点，而HN蛋白为NDV主要的免疫原蛋白，检测抗HN蛋白抗体水平与检测抗全病毒抗体水平存在一致性。刘铀等［11］用T4噬菌体表达的重组新城疫病毒HN蛋白为包被抗原，建立了检测新城疫抗体的间接ELISA方法，该方法检测灵敏度明显高于HI和AGP试验，但该研究未进行灵敏度的标定，也没有进行临床样品的应用检测，没有对该检测方法进行应用评价。本研究以原核表达的NDV HN重组蛋白作为包被抗原，建立了检测NDV HN抗体的间接ELISA诊断方法，该检测方法显示出了较好的特异性、敏感性、重复性和适用性，将具有良好的使用前景。本实验室将进一步进行间接ELISA试剂盒稳定剂的研究工作，以便尽早将该检测方法组装成诊断试剂盒，为NDV抗体检测、流行病学调查等提供一种简便、敏感、快速、特异的血清学诊断试剂盒。

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