流式细胞技术的临床应用与分析

董兴艳

流式细胞技术的临床应用与分析

董兴艳

流式细胞技术是激光为光源，集流力学技术，电子物理技术，光电测量技术，计算机技术以及细胞荧光化学技术，单克隆抗体技术为一体的新型技术仪，应用流式细胞仪对处于快速直线流动状态中的细胞或生物颗粒经行快速的，多参数的，定量分析和分选技术称为流式细胞技术(FCM)［1］。其中生物颗粒包括大的免疫复合物，DNA，RNA，蛋白质，病毒颗粒，脂质体，细胞器，细菌，染色体，真核细胞，杂交细胞，聚集细胞等，所检测的生物颗粒理化性质包括大小，细胞形态，胞浆颗粒化程度，DNA含量，总蛋白含量，细胞膜的完整性和酶活性学。由于融合了单克隆抗体技术，定量细胞化学和定量荧光化学，流式细胞技术作为一门生物检测技术已经日臻完善，流式细胞或在生物学，免疫学，胞瘤学，血液学，病理性，遗传学，临床检验等学科中都得到广泛的应用，并将为医学科学研究发挥更大的作用。

1 生物分析原理

将悬浮分散的单细胞悬液，经特异荧光染料染色后，放入样品管，在气体压力的作用下，悬浮在样品管中的单细胞悬液形成样品流垂直进入流式细胞仪的流动室，沿流动室的轴心向下流动，流动室轴心至外壁的鞘液也向下流动，形成包绕细胞悬液的鞘液流，鞘液和样品在喷嘴附近组成一个圆柱流束自喷嘴的圆形孔喷出，于水平方向的激光束垂直相交，相交点成为测量区。染色的细胞经激光照射后发出荧光，同时产生光散射。这些信号分别被呈90℃角方向放置的光电倍增管荧光检测器和向前角放置的光电二级管散射光检测器接收，经转换器转换或电子信号后，经模/数转换输入计算机，计算机通过相应的软件储存，计算，分析这些数字化信息，就可得到细胞的大小活性，核酸含量，酶和抗原的性质学物理和生化指标。

2 细胞分选原理

在压电晶体上加上频率为30kH2的信号，使之产生同频率的机械振动，流动室也就随之振动，于是通过测量区的液柱断裂成一连串均匀的液滴。由于各类细胞的特性信息在细胞形成或液滴以前在测量区已被测定，并储存在计算机中，因此当某类细胞特性与要分选的细胞相同时，流式细胞仪就会在这类细胞形成液滴时给含有这类细胞的液滴充以标定的电荷，而不符合分选条件含细胞悬液滴及不含细胞的空白液滴不被充以特定电荷。带有电荷的液滴向下落入偏转板间的静电场时，依所带电荷的符号分别向左偏转和向右偏转。落入指定的搜集器内，不带电的液滴不发生偏转，垂直落入废液槽中被排出，从而达到细胞分类，收集的目的。

3 主要性能指标

荧光测量的灵敏度:流式细胞技术均可检测到＜600个荧光分子指标。一般是以检测到单个微球上最少存有FTTC或0E荧光数目来显示。

分辨率:分辨率是衡量仪器测量精度的指标，通常用变异系数CV表示，流式细胞仪最佳状态CV＜2%。

流式细胞仪的分选速度为:3000个/s～6000个/s。大型仪器可达每秒几万个细胞。

4 流式细胞技术的临床应用与分析

流式细胞仪是今年来发展起来的现代细胞学分析技术中的常用仪器。它具备快速，准确量，化学特性。目前已广泛应用于免疫学，细胞生物学，血液学，肿瘤学，病理学，遗传学，临床经验学多领域。

4.1 FCM在免疫学中的应用 流式细胞术是在细胞分析和分选的基础上发展起来的一种新的细胞参数计量技术。它以其快速灵活和定量的特点，广泛应用于免疫学理论研究和临床实践:有现代免疫技术基石之一之称。尤其同单克隆抗体的结合应用，在淋巴细胞及其亚群分析，淋巴细胞功能分析，免疫分型，分选，肿瘤细胞的免疫检测，机体免疫状态的监测，免疫细胞系统发生及特性研究等方面都起着相对重要作用。

4.2 在血液学中的应用 血液病多为肿瘤性，免疫性和遗传性疾病，恶性血液病约占总数的一半以上，流式细胞仪(FCM)在血液病及淋巴瘤的发病机制，诊断治疗和预后判断学方面都具有重要价值。

白血病患者的异常细胞在分化过程中受外因，内因或突变等因素的影响曾克隆性异常增殖。白血病的免疫分型是选择化疗方案和判断预后的重要依据。FCM结合单克隆抗体的应用对白血病经行免疫分型。可以提高白血病分型诊断的符合率。可为指导治疗和判断预防提供帮助。

4.3 流式细胞技术在细胞生物学中的应用 流式细胞技术在细胞生物领域内的应用，是流式细胞仪在基础研究中应用范围最广的领域。目前细胞生物学研究中，应用最频繁也是最普通的是细胞周期分析，包括细胞周期个时期的百分比和细胞周期动力学参数的测定内容。在方法学上除一般的化学染色方法外还有抗溴脱氧脲嘧啶核苷单克隆抗体技术，对同一细胞的参数测定技术则导致了对细胞周期的一些新发现，典型的方法是吖啶橙双染技术，这个技术不仅可以进行细胞周期分析，而且给细胞周期的研究带来了一些新的概念。流式细胞测量术和分选术在染色体，精子，和精细胞的研究及遗传学，分子遗传学也都有用武之地。

4.4 流式细胞术在肿瘤学中的应用 流式细胞仪在肿瘤学研究方面已成为重要手段之一。近年来引起肿瘤研究者的极大关注。对于制定近年来荧光细胞化学技术的发展以及荧光探针标记单克隆抗体为流式细胞技术研究各种肿瘤抗原，肿瘤蛋白，致癌基因开辟了新途径，极大地提高了肿瘤研究水平，并为流式细胞技术在肿瘤学研究中开辟了更广阔的应用前景。

4.5 流式细胞技术在AIDS病检测在的分析 流式细胞术用AIDS病免疫功能的检测的重要手段，采用参数荧光标记计数可对T淋巴细胞及亚群经行分析并通过动态监测T细胞亚群可以对HIV感染者或AIDS发病都进行区别。仅为HIV携带者，病毒未复制时，其Th细胞下降不明显。当发展为AIDS时Th细胞水平明显下降，如Th1细胞＜Th2细胞时，HIV在细胞间的传播和感染更敏感，易发生AIDS。同时，当HIV阳性而无症状的患者，其 Tc对 Tc激活剂不反应者，其体内CD+4Th细胞水平下降迅速。条件致病微生物感染率也同时增加，对Tc激活剂反应敏感者，可维持CD+4Th细胞水平降低较慢或不降低，减少发生AIDS的几率。

4.6 流式细胞仪对自身免疫性疾病相关HLA抗原的分析

有些疾病的发病常与一些类型的HLA抗原检出有关，在这些疾病中，某些HLA抗原检出率比正常人群检出率高，最典型疾病是强直性脊柱炎，其外用HLA-B27表达及表达程度与疾病的发生有很高的相关性，利用FCM可以进行HLA-B27/HLA-B7双标记抗体检测HLA-B27阳性细胞，同时又排除交叉反应。通58%～97%的强直性脊柱炎患者可检出这种抗原，而正常人仅为2%～7%检出这种抗原。FCM检测HLAB27快速，特异，敏感，为强直性脊柱炎的临床诊断提供了有力帮助。

总之，流式细胞技术在血液学，肿瘤，细胞生物学和自身免疫性疾病临床诊断治疗中具有广泛的应用价值。

［1］ 王兰兰，吴健民.临床免疫学与检验.人民卫生出版社出版，2004．

230400鹤岗市人民医院