四川高效大豆根瘤菌的筛选及初步应用研究

周涛，陈远学，邹依霖，李克祥，汪鹏，蒋攀，徐开未

(四川农业大学资源环境学院，四川雅安625014)

四川是我国南方大豆的主产区，但四川大豆需求量远大于产量，年消耗量在200万吨左右，而年产量仅有50万吨，缺口150万吨以上［1］。近年来“小麦/玉米/大豆”旱作新三熟种植模式在四川山地丘陵区得到大力推广，四川大豆种植面积随之大幅度增加［2］。作为主要豆科作物，大豆有较强的共生固氮能力。豆科植物与根瘤菌共生固氮量占全球每年生物固氮量的70%，高效根瘤菌剂的使用可以减少化学氮肥的施用量，节约生产成本，降低化学氮肥过量施用造成的环境污染，且能提高大豆产量与品质［3］。土壤中75%以上的土著根瘤菌是低效或无效菌株，且竞争结瘤能力强，是高效固氮根瘤菌发挥生物固氮作用的重要限制因素［3－4］。优良菌株的筛选一般以菌株的固氮能力、与品种的匹配性和与土著菌的竞争能力作为评价指标，并还需在种植区进行田间试验确证后方可在生产上推广应用［3－6］。而至目前，四川大豆根瘤菌与大豆主栽品种的匹配性，高效菌株的筛选及田间应用的研究还鲜见报道。为此，本研究利用分离自四川33个市县区35个采样点的70株大豆根瘤菌株，采用无氮水培初筛，盆栽、田间试验复筛，通过比较供试根瘤菌的结瘤能力、共生固氮能力，以及田间小区试验的大豆产量为主要指标，筛选与四川主栽大豆品种“贡选1号”匹配性好的菌株，为该地区高效大豆根瘤菌剂的研制与应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

大豆品种为“贡选1号”，由四川省自贡市农科所选育。供试菌种是从采集自四川省33个市县35个采样点的根瘤中分离出的70个根瘤菌株，其基本状况见表1。

供试土壤：盆栽试验用土为采自四川雅安草坝镇青衣江的潮湿雏形土(潮土)，基本养分状况：pH 5.9，有机质含量13.3 g/kg，全氮0.30 g/kg，碱解氮70.2 mg/kg，有效磷 30.2 mg/kg，速效钾 26.9 mg/kg。大田试验在四川农业大学雅安校区农场进行，土壤为紫色湿润雏形土(紫色大土)，其pH 6.7，有机质含量35.4 g/kg、全氮0.70 g/kg、碱解氮95.2 mg/kg、有效磷 31.2 mg/kg、速效钾 54.4 mg/kg。

1.2 试验方法

1.2.1 第一次水培筛选 第一次水培实验：将从四川21个市县区23个采样点分离纯化获得的52个大豆根瘤菌株(见表1)，于2008年12月3日至2009年1月6日用无氮水培法进行大豆回接实验。对照不接种，每个处理重复3次。催芽和播种方法按参考文献［7］进行。温室培养35 d后收获，测定植株鲜重、干重和总瘤数。

1.2.2 盆栽复筛 2009年5月12日至2009年8月2日，用第一次水培实验筛选到的6个高效菌株(S8，S22，S36，S46，S55，S65)分别制成 6 种根瘤菌剂，菌剂的生产及质量检测方法同参考文献［8］，贮存48 d(活菌数均在5亿/g以上)进行盆栽试验。每盆装土6 kg，根瘤菌剂采用拌种法，用量为1 g/盆，播种深度2 cm左右，每盆播种4粒，定苗2株，以不接种为对照，共7个处理，重复3次。盛花期(生育期83 d)测定植株鲜重、干重、株高、总瘤数，方法同参考文献［8］。

1.2.3 第二次水培筛选 以从四川另外12个市县区12个采样点分离的18个大豆根瘤菌菌株(见表1)为供试菌，以盆栽复筛出的2个高效大豆根瘤菌株(S8，S36)作阳性对照，以不接种CK作阴性对照，于2010年4月29日至2010年6月16日进行第二次水培回接筛选实验。温室培养49 d收获，测定植株鲜重、干重和总瘤数。

1.2.4 大田试验 盆栽试验和第二次水培实验共筛选到5株与四川主栽大豆品种“贡选1号”结瘤能力和共生固氮能力均强的大豆根瘤菌株(S8，S149，S150，S151，S152)，将这 5 个菌株制成 5 种根瘤菌剂，方法同1.2.2，于2010年6月26日至2010年11月6日进行田间随机区组试验。试验共设5个根瘤菌剂处理和1个不接种(对照)处理，小区面积2 m2，每个处理重复3次。根瘤菌剂采用拌种法，每小区用量2.5 g，在贮存期10 d(活菌数均在5亿/g以上)进行。窝距33 cm、行距35 cm，每窝播6粒，定苗3株。盛花期(生育期 80 d)测定植株鲜重、干重、株高、总瘤数、平均单瘤重;收获期(生育期134 d)测定饱荚数、瘪荚数、植株干重(收获时植株叶子基本掉完，干重仅为植株茎荚干重)、豆粒产量、饱瘪比(饱瘪比=饱荚数/瘪荚数)，地上部植株样品用 H2SO4－H2O2消煮联合测定氮、磷、钾含量［9］。

试验数据用Excel 2007和SPSS 17.0进行统计分析。

表1 供试菌株基本状况Table 1 Rhizobia strains used in this study

2 结果与分析

2.1 第一次水培筛选结果分析

第一次无氮水培初筛结果表明，52个根瘤菌处理全部结瘤，结瘤数为0.7～30.7个/株，CK未结瘤;植株干重高于 CK(0.47 g/株)的有31个(占59.6%)菌株处理，但显著或极显著高于CK的仅有S8、S22、S36、S46、S55、S65 6 个菌株处理，其植株干重为 0.65～0.70 g/株，结瘤数为 17.3～28.3个/株;另有2株(S16、S26)的植株鲜重显著低于CK，其结瘤数为1.3～2.7个/株。可见，在本次水培实验中，植株干重高的处理其结瘤量中等，结瘤能力过弱或过强的菌株表现低效或无效，可能是结瘤能力过弱的菌株，即使固氮能力强但固氮量也有限;相关研究表明，绝大多数土著根瘤菌形成的根瘤的固氮效率不高，为大豆生长提供的氮素营养有限［5，6］，若结瘤能力过强，消耗宿主营养多，故表现为低效或无效。在第一批供试的52株根瘤菌中，仅有11.5%是高效菌株，大多数(88.5%)是低效、无效菌株。为此初步筛选出与“贡选1号”共生匹配性好的大豆根瘤菌为 S8、S22、S36、S46、S55、S65，这6个菌株作为后续盆栽复筛试验的供试菌株。

2.2 盆栽复筛结果分析

2.2.1 接种根瘤菌对大豆结瘤的影响 将第一次水培筛选获得的6个高效大豆根瘤菌株(S8、S22、S36、S46、S55、S65)接种“贡选 1 号”进行土壤盆栽试验，植株结瘤情况见表2，除S55外，其他5个菌株(S8、S22、S36、S46、S65)处理的结瘤数均高于CK，其中S8和S36处理的根瘤数显著、极显著高于CK，分别比 CK增加86.6%和72.2%。说明 S8、S36结瘤能力强，或可促进土著根瘤菌结瘤。

2.2.2 接种根瘤菌对大豆植株生长的影响 从表2知，S8、S36处理的植株鲜重、干重均明显高于CK，S36植株鲜重比CK显著增加32.1%;S46、S65的植株干重、鲜重均低于CK，但差异不显著。综合结瘤能力和共生固氮能力，S8、S36结瘤能力最强，且其植株鲜重、干重比CK的增加量最大，说明在有土著根瘤菌存在的情况下，S8、S36与“贡选1号”的共生匹配性最好。

表2 接种根瘤菌对大豆生长的影响(盆栽试验)Table 2 Effect of rhizobia inoculation on soybean growth(pot experiment)

2.3 第二次水培筛选结果与分析

将第二次分离纯化得到的18株根瘤菌(表1)，以盆栽复筛得到的S8、S36和不接种CK分别作为阳性和阴性对照，用水培法回接“贡选1号”，从中筛选高效菌株。18个菌株全部结瘤，植株结瘤数为26.3～68.0个/株。所有菌株处理的植株干重均高于CK，其中显著或极显著高于CK(0.91 g/株)的有6个菌株(S149、S150、S151、S152、S159、S163)处理，其植株干重为 1.15～1.36 g/株。且 S149、S150、S151、S152 4个处理的植株干重高于阳性对照S8(1.28 g/株)、S36(1.23 g/株)，但差异未达显著水平;其植株结瘤数为30.0～39.0个/株。植株干重和单瘤重的相关系数(r=0.381＊＊)达极显著水平，可见单瘤重对植株的固氮能力影响较大。

两次水培实验均表明结瘤数太少或太多的菌株是中、低效菌株，而共生固氮效果显著的菌株其结瘤量中等。从第二次水培实验中筛选到的 S152、S151、S150、S149 4个菌株是与“贡选1号”大豆品种共生匹配性好的菌株。

2.4 田间试验结果分析

综合前期筛选结果，选择5个菌株S152、S151、S150、S149、S8进行田间随机区组试验作进一步筛选应用。

2.4.1 接种根瘤菌对大豆植株生长的影响 接种不同根瘤菌对盛花期大豆植株生长影响较大。接种S152、S151、S150的植株株高、鲜重和干重均高于CK，其干重分别比 CK增加11.8%、8.1%、6.6%，但与CK的差异未达显著水平。S8和S149的盛花期大豆的株高、鲜重和干重均低于CK。5个接种处理的大豆根瘤数均未高于CK(表3)。但从表3可以看出，根瘤菌处理的收获期植株干重均高于CK，且S152最高。植株茎氮、磷、钾含量均高于CK。接种S152的植株氮、磷、钾含量最高，比CK分别增加26.9%、22.2%、38.6%。说明接种根瘤菌不仅能促进寄主植物对氮的吸收，还能促进对磷、钾的吸收，这与徐开未等［8，10］的研究结果一致。

2.4.2 接种根瘤菌对大豆产量的影响 接种不同根瘤菌对大豆产量的影响存在显著差异。表4显示，除S151外，其他菌剂处理的大豆产量均高于CK。S152、S150处理的大豆产量比CK高33.5%、18.5%，达显著水平，且显著高于S8、S149、S151处理。接种处理的植株结荚数均高于CK，但差异不显著;S152、S150以结二粒荚为主，S152饱荚数极显著高于CK，瘪荚数低于其他5个处理，S152、S150饱瘪比(饱荚数和瘪荚数之比)分别为3.79、3.05，明显高于其他接种菌株和CK;以结单粒荚为主的S151、S149结荚量最大，饱荚数、瘪荚数均明显高于CK，但产量与CK间的差异不显著。饱瘪比与产量相关性达显著水平(r=0.548*)。可见，高效根瘤菌的增产主要是通过增加大豆的二粒饱荚数，提高饱荚率来实现的。

表3 接种根瘤菌对大豆生长及茎氮、磷、钾含量的影响Table 3 Effects of rhizobia inoculation on soybean growth and total N，P and K contents in plant stems

表4 接种根瘤菌对收获期大豆产量的影响Table 4 Effects of rhizobia inoculation on yield of the soybean at the harvest stage

综上，从接种根瘤菌对供试大豆品种的生长性状及产量的影响来看，S152和S150是与四川主栽大豆品种“贡选1号”和供试土壤匹配性好的菌株，且S152最佳。

3 讨论

高效根瘤菌的筛选工作繁琐又复杂。首先用大量菌株针对作物品种以无菌基质(无氮水培或蛭石)在温室中筛选一批共生效果高的菌株;然后以种植区土壤为基质，筛选出与土著菌竞争结瘤能力强的菌株;最后在种植地区进行田间小区试验确证后方能推广应用接种［3］。土壤理化性质、肥力水平、土著根瘤菌的数量等因素都直接影响根瘤菌的竞争结瘤能力［11－12］，氮素水平较低的土壤能够提高接种剂的成功率［13］。本研究正是应用无氮水培、盆栽和田间试验筛选菌株，而在不同试验条件下有的菌株共生有效性表现不一致。如S8在两次水培实验和盆栽试验中均表现较好，说明S8与供试大豆品种的共生匹配性好，但在田间试验中对大豆的增产效果不明显，可能与土著根瘤菌的竞争结瘤能力有关，可见，高效菌株的筛选必须要在种植区进行田间试验确证后方能推广应用。在肥力水平相差较大的不同土壤中可能竞争结瘤能力差别较大。在第二次水培实验中，结瘤能力较强且植株干重极显著高于对照的5个菌株，其植株干重表现为S151＞S152＞S149＞S150=S8＞CK，说明这些菌株与四川大豆主栽品种“贡选1号”具有良好的亲和性，但在大田试验中这5个菌株共生固氮能力有明显的差异，S152、S150的产量显著高于对照，而S151的产量还略低于对照，可能是因为与供试大豆共生匹配性好的这5个菌株中，S152和S150比供试土壤土著根瘤菌的竞争能力强，而S151最差，这需要后续的竞争结瘤试验加以证实。菌株的竞争结瘤能力是接种成功的关键［3，5，11］，为此，本研究也将继续对田间试验筛选到的高效菌株进行分子标记用以检测其占瘤率，考察接种菌与四川大豆种植土壤的适应性和与土著根瘤菌的竞争结瘤能力，以期获得适应四川大豆种植区土壤、与四川主栽大豆品种“贡选1号”匹配性最佳的高效菌株。

在考察根瘤菌与宿主的共生固氮效果时，经常用盛花期植株地上部分鲜重、干重等指标评价菌株的共生有效性［8，10］。本试验所得高效菌株在水培实验、盆栽试验中盛花期植株干重、鲜重均比对照明显增加;大田试验中盛花期植株鲜重、干重与对照相当或略有增加，可能是因为试验田在种植双胞蘑菇后土壤较肥沃，高效根瘤菌的共生固氮效果在生长前期还没显著体现出来。而到生殖生长期，高效菌株的固氮效率得以显著体现：接种S152和S150的大豆产量均显著高于对照和其他三个接种菌株S151、S149、S8。众所周知，根瘤菌的共生固氮能力，在含氮量越低的土壤中表现得越明显，而本研究筛选到的S152和S150两个菌株在较肥沃土壤中接种“贡选1号”，其产量仍与对照的差异达显著水平，说明这两个菌株在四川大豆生产中有良好的应用前景。而S151、S149、S8虽在水培试验中表现为高效菌株，但在田间试验中表现无效或低效，可能也与该土壤的肥力水平和土著根瘤菌的竞争结瘤能力的影响有关。

植株氮、磷、钾的吸收是产量形成的基础，大豆是需钾量较高的作物［14］。接种根瘤菌能为植株提供氮素，同时促进磷、钾的吸收。焦如珍等［15］认为根瘤菌有溶磷能力，且同一属种的根瘤菌不同菌株之间溶磷能力相差巨大。张慧等［16］用根瘤菌接种大叶相思幼苗的研究表明，6个供试菌株的溶钾效果均较明显，但仅有1个菌株有较好的溶磷能力。而本研究中，两高效菌株S152、S150接种的植株氮、磷、钾含量明显高于对照，且全钾含量的增幅最大，分别比对照增加38.5%、40.7%，而田间试验表现无效的菌株S151接种植株的含钾量还略低于对照，可能是这两个高效根瘤菌(S152、S150)有一定的溶钾溶磷能力，且高效菌株的共生固氮与钾的协同作用好。这两株高效菌的溶钾溶磷能力有待进一步研究和开发利用。

紫色土是四川最重要的旱耕地，潮土也是较重要的旱耕地之一［17］，四川大豆种植区土壤主要是紫色土和潮土等，若能筛选到与这两种未灭菌的自然土壤适应性均好的高效菌株，在四川应有较好的应用潜力。本研究从四川33个市县35个采样点分离获得的70个大豆根瘤菌株中通过无氮水培、盆栽(潮土)和大田小区试验(紫色土)筛选出了与四川大豆主栽品种“贡选1号”匹配性最佳的菌株S152和S150，这为四川大豆高效根瘤菌的进一步筛选鉴定，高效根瘤菌剂的研制与应用奠定了良好基础，具有重要的生产应用价值。

［1］雍太文，杨文钰，任万军，等．发展套作大豆促进四川大豆产业发展［J］．作物杂志，2007，6：5－8.

Yong T W，Yang W Y，Ren W Jet al．Promotion of soybean industry by popularization of relay-planting soybean in Sichuan Province［J］．Crops，2007，6：5 －8.

［2］杨文钰，雍太文，任万军，等．发展套作大豆，振兴大豆产业［J］．大豆科学，2008，27(1)：1－7.

Yang W Y，Yong T W，Ren W Jet al．Develop relay-cropping soybean，revitalize soybean industry ［J］．Soybean Sci．，2008，27(1)：1－7.

［3］李俊，沈德龙，林先贵．农业微生物研究与产业化进展［M］．北京：科学出版社，2011.289－292.

Li J，Shen D L，Lin X G．Agricultural microbiology research and industrialized progress［M］．Beijing：Science Press，2011.289－292.

［4］马中雨，李俊，张永芳，等．大豆根瘤菌与大豆品种共生匹配性研究［J］．大豆科学，2008，27(2)：221－227.

Ma Z Y，Li J，Zhang Y Fet al．Symbiotic matching between soybeanrhizobiumand soybean cultivars［J］．Soybean Sci．，2008，27(2)：221－227.

［5］李涛，关大伟，李俊，等．黄淮海地区优良大豆根瘤菌株的筛选与接种方式研究［J］．大豆科学，2010，29(4)：645－649.

Li T，Guan D W，Li Jet al．Screening of superior soybean rhizobial strains and approach to inoculation methods for region of HuangHuaiHai［J］．Soybean Sci．，2010，29(4)：645 －649.

［6］Marta A，Dulce N R – N，Francisco J T．Soybean inoculation：Dose N fertilizer supplementation and rhizobia persistence in soil［J］．Field Crops Res．，2009，113：352 －356.

［7］徐开未，张小平，陈远学，等．GUS基因标记法对慢生花生根瘤菌竞争结瘤和接种效果的研究［J］．中国土壤与肥料，2006，(3)：51－53.

Xu K W，Zhang X P，Chen Y Xet al．Studies on competitive nodulation and efficiency ofbradyrhizobiumsp．(Arachis)using GUS marker gene［J］．China Soils Fert．，2006，(3)：51 －53.

［8］徐开未，陈远学，张小平，等．Mo与花生根瘤菌的复合菌剂对盛花期花生生长的影响［J］．水土保持学报，2009，23(2)：198－201.

Xu K W，Chen Y X，Zhang X Pet al．Effects of combined inoculant with peanut bradyrhizobium and molybdate on peanut growth in florescence stage［J］．J．Soil Water Conserv．，2009，23(2)：198－201.

［9］鲍士旦．土壤农化分析(第三版)［M］．北京：中国农业出版社，2000．263－270.

Bao S D．Soil and agricultural chemistry analysis(Third edition)［M］．Beijing：China Agriculture Press，2000．263－270.

［10］徐开未，张小平，陈远学．“根瘤菌+Mo”菌剂和AM菌剂对花生生长和产量的影响［J］．中国油料作物学报，2009，31(2)：228－232.

Xu K W，Zhang X P，Chen Y X ．Effects of co-inoculation of bradyrhizobium with molybdate and arbuscular mycorrhizal fungi on growth and yield of peanut plants［J］．Chin．J．Oil Crop Sci．，2009，31(2)：228 －232.

［11］何庆元，胡艳，玉永雄．生态环境对根瘤菌竞争结瘤影响的研究进展［J］．大豆科学，2004，23(1)：66－70.

He Q Y，Hu Y，Yu Y X．Advance the study of the nodulation competition of rhizobium in environment［J］．Soybean Sci．，2004，23(1)：66－70.

［12］刘晓云，郭振国，李乔仙，等．南苜蓿高效共生根瘤菌土壤的筛选［J］．生态学报，2011，31(14)：4034－4041.

Liu X Y，Guo Z G，Li Q Xet al．Screening of highly-effective rhizobial strains on alfalfa(Medicago polymorpha)in soil［J］．Acta Ecol．Sin．，2011，31(14)：4034 －4041.

［13］Bushby H V A．Colonization of rhizospheres by bradyrhizobim sp．in relation to strain persistence and nodulation of some pasture legumes［J］．Soil Biol．Biochem．，1993，25(5)：597－605.

［14］金晓梅，СИНеГОВ ская ВТ，赵念力．根瘤菌、微肥和作物生长调节剂对大豆氮磷钾积累和产量的影响［J］．大豆科学，2009，28(4)：751－754.

Jin X M，Sinegovskaya V T，Zhao N L．Influence of rhizobium，trace fertilizer and crop growth regulators on nitrogen，phosphorous，potassium accumulation and yield of soybean ［J］．Soybean Sci．，2009，28(4)：751 －754.

［15］焦如珍，彭玉红．海南岛热带木本豆科植物根瘤菌的溶磷作用［J］．林业科学，2010，46(10)：1－5.

Jiao R Z，Peng Y H．Phosphate solubilization by rhizobia isolated from woody legume plants in Hainan island ［J］．Sci．Silv．Sin．，2010，46(10)：1－5.

［16］张慧，余永昌，黄宝灵，等．接种根瘤菌对直杆型大叶相思幼苗生长及土壤营养元素含量的影响［J］．东北林业大学学报，2005，33(5)：47－48，50.

Zhang H，Yu Y C;Huang B Let al．Effects of rhizobia inoculation on the growth of straight-stemAcacia auriculaeformisseedlings and the contents of soil nutritive elements［J］．J．Northeast For．Univ．，2005，33(5)：47 －48，50.

［17］刘世全，张明．区域土壤地理［M］．成都：四川大学出版社，1996．220－224.

Liu S Q，Zhang M．Regional soil geography［M］．Chengdu：Sichuan University Press，1996．220 －224.